從武漢鋼鐵廠污泥樣本中分離到一株對重金屬鎘具有高耐受的細菌，通過形態(tài)學觀察、大量的生理生化實驗以及16Sr DNA序列的分析，將該細菌鑒定為惡臭假單胞菌，命名為Pseudomonas putida CD2。金屬的最大耐受濃度（MTC）實驗顯示了菌株CD2對多種二價的重金屬離子具有極高的耐受性。 利用轉座子Tn5-B21對菌株CD2進行了隨機插入突變，從12000個突變子中篩選獲得12個鎘離子敏感的突變株。使用inverse PCR方法克隆了突變株中Tn5-B21的側翼序列。結果發(fā)現有六個基因與重金屬鎘的耐受有關，他們分別是cadA2、czcC1、czcB1、czcA1、colR和colS。其中czcC1、czcB1和czcA1組成了操縱子czcCBA1；colR和colS組成了操縱子colRS。 czcCBA1的缺失嚴重的影響了P．putida CD2對各種二價重金屬離子的耐受能力，尤其是Cd²⁺、Zn²⁺和Co²⁺。其翻譯出的三個蛋白組成一個橫跨細胞壁的蛋白復合體，形成一個不需要能量的陽... 

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1.文獻綜述
    1.1 前言
    1.2 重金屬的污染途徑及對人類健康的危害
    1.3 微生物對重金屬的耐受機制
        1.3.1 微生物對重金屬的累積
        1.3.2 重金屬的微生物轉化
        1.3.3 金屬硫蛋白
        1.3.4 重金屬輸出系統(tǒng)
    1.4 假單胞菌的金屬抗性研究進展
    1.5 雙組分信號轉導系統(tǒng)簡介
    1.6 本研究的目的與意義
2.材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與質粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 試劑和緩沖液
        2.1.4 抗生素
    2.2 方法
        2.2.1 分子生物學常規(guī)操作
        2.2.2 菌株CD2的形態(tài)學觀察和生理生化鑒定
        2.2.3 菌株CD2對金屬的最大耐受濃度(MTC)的測定
        2.2.4 假單胞菌總DNA的提取
        2.2.5 16S rDNA的序列測定
        2.2.6 接合實驗
        2.2.7 Inverse PCR反應
        2.2.8 β-Galactosidase的活性測定
        2.2.9 核酸及蛋白質序列分析
3.結果與討論
    3.1 耐鎘細菌CD2的分離鑒定
        3.1.1 菌株的分離
        3.1.2 形態(tài)學觀察
        3.1.3 生理生化實驗
        3.1.4 16S rDNA序列分析
        3.1.5 抗藥性實驗
        3.1.6 Pseudomonas putida CD2的重金屬耐受能力
        3.1.7 小結與討論
    3.2 突變體庫的構建及鎘敏感突變體的篩選
        3.2.1 Tn5-B21插入突變體庫的構建
        3.2.2 鎘敏感突變菌株的篩選
        3.2.3 突變菌株的重金屬耐受能力
        3.2.4 小結與討論
    3.3 抗性基因的克隆
        3.3.1 Tn5-B21插入失活基因部分片段的PCR擴增
        3.3.2 Tn5-B21插入失活基因擴增片段的測序及序列分析
        3.3.3 小結與討論
    3.4 colRS全基因克隆及互補實驗
        3.4.1 colRS全基因克隆
        3.4.2 colRS核酸序列分析
        3.4.3 ColRS蛋白質序列的分析
        3.4.4 互補實驗驗證colRS的功能
        3.4.5 小結與討論
    3.5 抗性基因的金屬誘導活性
總結和展望
參考文獻
課題資助
博士研究生期間發(fā)表論文情況
附錄
致謝



本文編號：3703166