從武漢鋼鐵廠污泥樣本中分離到一株對(duì)重金屬鎘具有高耐受的細(xì)菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、大量的生理生化實(shí)驗(yàn)以及16Sr DNA序列的分析，將該細(xì)菌鑒定為惡臭假單胞菌，命名為Pseudomonas putida CD2。金屬的最大耐受濃度（MTC）實(shí)驗(yàn)顯示了菌株CD2對(duì)多種二價(jià)的重金屬離子具有極高的耐受性。 利用轉(zhuǎn)座子Tn5-B21對(duì)菌株CD2進(jìn)行了隨機(jī)插入突變，從12000個(gè)突變子中篩選獲得12個(gè)鎘離子敏感的突變株。使用inverse PCR方法克隆了突變株中Tn5-B21的側(cè)翼序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有六個(gè)基因與重金屬鎘的耐受有關(guān)，他們分別是cadA2、czcC1、czcB1、czcA1、colR和colS。其中czcC1、czcB1和czcA1組成了操縱子czcCBA1；colR和colS組成了操縱子colRS。 czcCBA1的缺失嚴(yán)重的影響了P．putida CD2對(duì)各種二價(jià)重金屬離子的耐受能力，尤其是Cd²⁺、Zn²⁺和Co²⁺。其翻譯出的三個(gè)蛋白組成一個(gè)橫跨細(xì)胞壁的蛋白復(fù)合體，形成一個(gè)不需要能量的陽(yáng)... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1.文獻(xiàn)綜述
    1.1 前言
    1.2 重金屬的污染途徑及對(duì)人類健康的危害
    1.3 微生物對(duì)重金屬的耐受機(jī)制
        1.3.1 微生物對(duì)重金屬的累積
        1.3.2 重金屬的微生物轉(zhuǎn)化
        1.3.3 金屬硫蛋白
        1.3.4 重金屬輸出系統(tǒng)
    1.4 假單胞菌的金屬抗性研究進(jìn)展
    1.5 雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)簡(jiǎn)介
    1.6 本研究的目的與意義
2.材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 試劑和緩沖液
        2.1.4 抗生素
    2.2 方法
        2.2.1 分子生物學(xué)常規(guī)操作
        2.2.2 菌株CD2的形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定
        2.2.3 菌株CD2對(duì)金屬的最大耐受濃度(MTC)的測(cè)定
        2.2.4 假單胞菌總DNA的提取
        2.2.5 16S rDNA的序列測(cè)定
        2.2.6 接合實(shí)驗(yàn)
        2.2.7 Inverse PCR反應(yīng)
        2.2.8 β-Galactosidase的活性測(cè)定
        2.2.9 核酸及蛋白質(zhì)序列分析
3.結(jié)果與討論
    3.1 耐鎘細(xì)菌CD2的分離鑒定
        3.1.1 菌株的分離
        3.1.2 形態(tài)學(xué)觀察
        3.1.3 生理生化實(shí)驗(yàn)
        3.1.4 16S rDNA序列分析
        3.1.5 抗藥性實(shí)驗(yàn)
        3.1.6 Pseudomonas putida CD2的重金屬耐受能力
        3.1.7 小結(jié)與討論
    3.2 突變體庫(kù)的構(gòu)建及鎘敏感突變體的篩選
        3.2.1 Tn5-B21插入突變體庫(kù)的構(gòu)建
        3.2.2 鎘敏感突變菌株的篩選
        3.2.3 突變菌株的重金屬耐受能力
        3.2.4 小結(jié)與討論
    3.3 抗性基因的克隆
        3.3.1 Tn5-B21插入失活基因部分片段的PCR擴(kuò)增
        3.3.2 Tn5-B21插入失活基因擴(kuò)增片段的測(cè)序及序列分析
        3.3.3 小結(jié)與討論
    3.4 colRS全基因克隆及互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)
        3.4.1 colRS全基因克隆
        3.4.2 colRS核酸序列分析
        3.4.3 ColRS蛋白質(zhì)序列的分析
        3.4.4 互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證colRS的功能
        3.4.5 小結(jié)與討論
    3.5 抗性基因的金屬誘導(dǎo)活性
總結(jié)和展望
參考文獻(xiàn)
課題資助
博士研究生期間發(fā)表論文情況
附錄
致謝



本文編號(hào)：3703166