尼古丁是N-雜環(huán)污染物的典型代表,1994年就被列入了美國環(huán)保局的有毒物質(zhì)釋放清單,致癮性和毒性很強(qiáng),容易誘發(fā)多種疾病。尼古丁污染主要來自于煙草工業(yè)中產(chǎn)生的富含尼古丁的煙草廢棄物和人們隨意丟棄的富含尼古丁的煙蒂垃圾。我國的煙草生產(chǎn)量和消費(fèi)量世界最大,每年產(chǎn)生的尼古丁污染物以百萬噸計(jì),極大地威脅著自然環(huán)境和人類健康。因此,消除尼古丁的污染迫在眉睫。微生物修復(fù)以其快速、高效、無二次污染的特點(diǎn)而受到大家的廣泛關(guān)注。目前已報(bào)道的尼古丁代謝微生物主要集中在節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌中。除尼古丁降解能力外,這些細(xì)菌還具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力,揭示它們的尼古丁代謝途徑和分子機(jī)制,探索其中關(guān)鍵酶的酶學(xué)和結(jié)構(gòu)特性,闡釋它們環(huán)境存活能力的基因基礎(chǔ),能夠指導(dǎo)對這些細(xì)菌的定向改造,具有極大的理論研究價(jià)值和應(yīng)用前景。根據(jù)其他推測或已報(bào)道的2,5-二羥基吡啶（2,5-DHP）代謝途徑,本研究首次提出并驗(yàn)證了假單胞菌中尼古丁吡咯烷下游代謝途徑如下:尼古丁降解生成的2,5-DHP開環(huán)裂解生成N-甲�；R來酰胺酸（NFM）,然后NFM去甲酰生成馬來酰胺酸和甲酸,馬來酰胺... 

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略表
第一章 前言
    1.1 氮雜環(huán)污染物概述
    1.2 尼古丁及其環(huán)境污染
        1.2.1 尼古丁的基本性質(zhì)
        1.2.2 尼古丁的毒害作用
        1.2.3 環(huán)境中的尼古丁污染
    1.3 微生物尼古丁代謝機(jī)制研究進(jìn)展
        1.3.1 尼古丁代謝微生物
        1.3.2 微生物代謝尼古丁的途徑及分子機(jī)制
            1.3.2.1 脫甲基代謝途徑
            1.3.2.2 吡啶代謝途徑及分子機(jī)制
            1.3.2.3 吡咯烷代謝途徑及分子機(jī)制
            1.3.2.4 吡啶吡咯烷交叉代謝途徑
            1.3.2.5 五條吡咯烷途徑變化途徑
        1.3.3 微生物尼古丁代謝相關(guān)酶的酶學(xué)研究進(jìn)展
    1.4 尼古丁代謝細(xì)菌的基因組學(xué)研究
        1.4.1 Pseudomonas putida S16基因組
        1.4.2 Pseudomonas geniculata N1基因組
        1.4.3 Nocardioides sp. JS614及Rhodococcus opacus B4基因組
        1.4.4 尼古丁代謝節(jié)桿菌的基因組學(xué)研究
    1.5 本課題的研究意義
第二章 假單胞菌S16尼古丁下游代謝關(guān)鍵基因/簇分離鑒定
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 儀器、試劑和緩沖液
        2.2.2 菌株、質(zhì)粒和引物
        2.2.3 培養(yǎng)基及菌株培養(yǎng)條件
        2.2.4 分子生物學(xué)操作
        2.2.5 休止細(xì)胞制備
        2.2.6 HPLC檢測休止細(xì)胞的降解能力
        2.2.7 簡并引物設(shè)計(jì)
        2.2.8 進(jìn)化樹構(gòu)建
        2.2.9 總RNA提取
        2.2.10 反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)
        2.2.11 P. putida S16電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞制備
        2.2.12 P. putida S16基因敲除菌株構(gòu)建
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 簡并引物擴(kuò)增尼古丁代謝下游基因（簇）
            2.3.1.1 P. putida S16休止細(xì)胞降解 2,5-DHP
            2.3.1.2 設(shè)計(jì)簡并引物
            2.3.1.3 摸索簡并引物PCR擴(kuò)增的退火溫度
            2.3.1.4 簡并引物PCR擴(kuò)增可能的目的基因
            2.3.1.5 簡并引物PCR產(chǎn)物的克隆及測序鑒定
            2.3.1.6 構(gòu)建hpo基因的重組表達(dá)質(zhì)粒
            2.3.1.7 hpo基因功能初步探索
            2.3.1.8 定位尼古丁下游代謝基因簇nic2
        2.3.2 nic2基因簇生物信息學(xué)分析
        2.3.3 代謝物對nic基因簇各基因轉(zhuǎn)錄的影響
        2.3.4 nic2基因簇在尼古丁代謝中的關(guān)鍵作用
            2.3.4.1 檢測P. putida S16能否降解煙酸
            2.3.4.2 構(gòu)建P. putida S16基因敲除突變株
            2.3.4.3 各基因敲除菌株的尼古丁代謝能力
    2.4 本章小結(jié)
第三章 2,5-二羥基吡啶雙加氧酶（Hpo和NicX）的性質(zhì)研究
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 儀器、試劑和緩沖液
        3.2.2 菌株、質(zhì)粒和引物
        3.2.3 培養(yǎng)基及菌株培養(yǎng)條件
        3.2.4 分子生物學(xué)操作
        3.2.5 外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.6 粗酶液制備
        3.2.7 帶His標(biāo)簽蛋白的親和純化
        3.2.8 不帶標(biāo)簽Hpo的純化
        3.2.9 蛋白濃度測定
        3.2.10 Hpo定點(diǎn)突變
        3.2.11 酶活性檢測
        3.2.12 酶動力學(xué)參數(shù)確定
        3.2.13 凝膠層析確定活性蛋白大小
        3.2.14 O_2消耗檢測
        3.2.15 ~(18)O標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
        3.2.16 非血紅素Fe~(2+)依賴型雙加氧酶進(jìn)化樹分析
        3.2.17 Hpo保守序列分析
        3.2.18 Hpo及其突變體Fe~(2+)結(jié)合比例測定
        3.2.19 Hpo底物特異性檢測
        3.2.20 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.2.21 蛋白二級結(jié)構(gòu)含量分析
        3.2.22 檢測技術(shù)
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 His-Hpo的誘導(dǎo)、表達(dá)和純化
        3.3.2 His-Hpo的酶學(xué)性質(zhì)
            3.3.2.1 His-Hpo的聚合狀態(tài)
            3.3.2.2 pH對His-Hpo酶活的影響
            3.3.2.3 溫度對His-Hpo酶活的影響
            3.3.2.4 金屬離子對His-Hpo酶活的影響
            3.3.2.5 His-Hpo的酶動力學(xué)參數(shù)
        3.3.3 無外源氨基酸的Hpo的表達(dá)純化
        3.3.4 Hpo與His-Hpo的性質(zhì)比較
            3.3.4.1 Hpo的聚合狀態(tài)
            3.3.4.2 pH、溫度和金屬離子對Hpo酶活的影響
            3.3.4.3 Hpo的酶動力學(xué)參數(shù)
            3.3.4.4 總結(jié)比較
        3.3.5 Hpo的酶學(xué)性質(zhì)
            3.3.5.1 Hpo催化反應(yīng)中的O_2消耗
            3.3.5.2 Hpo催化反應(yīng)產(chǎn)物中的O原子來源
            3.3.5.3 Hpo的底物特異性
            3.3.5.4 Hpo的氨基肽酶活性
            3.3.5.5 Hpo的去甲酰酶活性
        3.3.6 Hpo三維結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.3.7 Hpo定點(diǎn)突變
            3.3.7.1 Hpo點(diǎn)突變體的表達(dá)純化
            3.3.7.2 Hpo點(diǎn)突變體的 2,5-DHP雙加氧酶活性
            3.3.7.3 Hpo及其點(diǎn)突變體的Fe~(2+)結(jié)合能力
            3.3.7.4 Hpo及其點(diǎn)突變體的二級結(jié)構(gòu)
        3.3.8 Hpo與NicX結(jié)構(gòu)與性質(zhì)比較
            3.3.8.1 Hpo與NicX的結(jié)構(gòu)比較
            3.3.8.2 Hpo與NicX的催化活性比較
            3.3.8.3 Hpo與NicX的酶動力學(xué)參數(shù)比較
    3.4 本章小結(jié)
第四章 NFM去甲酰酶和馬來酰胺酸酰胺酶的性質(zhì)研究
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 儀器、試劑和緩沖液
        4.2.2 菌株、質(zhì)粒和引物
        4.2.3 培養(yǎng)基及菌株培養(yǎng)條件
        4.2.4 分子生物學(xué)操作
        4.2.5 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及濃度測定
        4.2.6 酶活性檢測
        4.2.7 序列比對
        4.2.8 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測
        4.2.9 檢測技術(shù)
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 nfo和ami基因的表達(dá)菌株構(gòu)建
        4.3.2 His-Nfo蛋白的純化
        4.3.3 His-Nfo的酶學(xué)性質(zhì)
            4.3.3.1 His-Nfo催化NFM去甲�；蒆COOH
            4.3.3.2 His-Nfo催化NFM去甲�；神R來酰胺酸
            4.3.3.3 His-Nfo催化NFF的去甲�；�
            4.3.3.4 His-Nfo催化NFM和NFF水解的動力學(xué)參數(shù)
        4.3.4 Nfo的結(jié)構(gòu)預(yù)測
        4.3.5 His-Ami蛋白的純化
        4.3.6 His-Ami蛋白的酶活檢測
    4.4 本章小結(jié)
第五章 尼古丁代謝節(jié)桿菌M2012083比較基因組分析
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 菌株M2012083的來源與保藏
        5.2.2 菌株M2012083的培養(yǎng)
        5.2.3 菌株M2012083基因組提取
        5.2.4 16S rDNA進(jìn)化樹構(gòu)建
        5.2.5 菌株鑒定
        5.2.6 基因組測序及組裝
        5.2.7 基因組注釋
        5.2.8 比較基因組分析
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 菌株M2012083的鑒定
        5.3.2 節(jié)桿菌M2012083的基因組信息
        5.3.3 七株節(jié)桿菌的基因組比較
        5.3.4 節(jié)桿菌M2012083中尼古丁代謝相關(guān)基因
        5.3.5 節(jié)桿菌M2012083中壓力應(yīng)答相關(guān)基因
            5.3.5.1 滲透壓力應(yīng)答
            5.3.5.2 氧化壓力應(yīng)答
            5.3.5.3 冷或熱激應(yīng)答
            5.3.5.4 脫毒作用
            5.3.5.5 其他壓力應(yīng)答蛋白
    5.4 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄I 儀器設(shè)備
附錄II 主要試劑
附錄III 緩沖液
附錄IV 菌株及質(zhì)粒
附錄V 引物信息
附錄VI 標(biāo)準(zhǔn)曲線
附錄VII 七株節(jié)桿菌中的壓力應(yīng)答蛋白
致謝
攻讀博士期間（待）發(fā)表論文及所獲獎勵



本文編號：3679833