尼古丁是N-雜環(huán)污染物的典型代表,1994年就被列入了美國環(huán)保局的有毒物質釋放清單,致癮性和毒性很強,容易誘發(fā)多種疾病。尼古丁污染主要來自于煙草工業(yè)中產(chǎn)生的富含尼古丁的煙草廢棄物和人們隨意丟棄的富含尼古丁的煙蒂垃圾。我國的煙草生產(chǎn)量和消費量世界最大,每年產(chǎn)生的尼古丁污染物以百萬噸計,極大地威脅著自然環(huán)境和人類健康。因此,消除尼古丁的污染迫在眉睫。微生物修復以其快速、高效、無二次污染的特點而受到大家的廣泛關注。目前已報道的尼古丁代謝微生物主要集中在節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）細菌中。除尼古丁降解能力外,這些細菌還具有很強的環(huán)境適應能力,揭示它們的尼古丁代謝途徑和分子機制,探索其中關鍵酶的酶學和結構特性,闡釋它們環(huán)境存活能力的基因基礎,能夠指導對這些細菌的定向改造,具有極大的理論研究價值和應用前景。根據(jù)其他推測或已報道的2,5-二羥基吡啶（2,5-DHP）代謝途徑,本研究首次提出并驗證了假單胞菌中尼古丁吡咯烷下游代謝途徑如下:尼古丁降解生成的2,5-DHP開環(huán)裂解生成N-甲�；R來酰胺酸（NFM）,然后NFM去甲酰生成馬來酰胺酸和甲酸,馬來酰胺... 

【文章頁數(shù)】：222 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略表
第一章 前言
    1.1 氮雜環(huán)污染物概述
    1.2 尼古丁及其環(huán)境污染
        1.2.1 尼古丁的基本性質
        1.2.2 尼古丁的毒害作用
        1.2.3 環(huán)境中的尼古丁污染
    1.3 微生物尼古丁代謝機制研究進展
        1.3.1 尼古丁代謝微生物
        1.3.2 微生物代謝尼古丁的途徑及分子機制
            1.3.2.1 脫甲基代謝途徑
            1.3.2.2 吡啶代謝途徑及分子機制
            1.3.2.3 吡咯烷代謝途徑及分子機制
            1.3.2.4 吡啶吡咯烷交叉代謝途徑
            1.3.2.5 五條吡咯烷途徑變化途徑
        1.3.3 微生物尼古丁代謝相關酶的酶學研究進展
    1.4 尼古丁代謝細菌的基因組學研究
        1.4.1 Pseudomonas putida S16基因組
        1.4.2 Pseudomonas geniculata N1基因組
        1.4.3 Nocardioides sp. JS614及Rhodococcus opacus B4基因組
        1.4.4 尼古丁代謝節(jié)桿菌的基因組學研究
    1.5 本課題的研究意義
第二章 假單胞菌S16尼古丁下游代謝關鍵基因/簇分離鑒定
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 儀器、試劑和緩沖液
        2.2.2 菌株、質粒和引物
        2.2.3 培養(yǎng)基及菌株培養(yǎng)條件
        2.2.4 分子生物學操作
        2.2.5 休止細胞制備
        2.2.6 HPLC檢測休止細胞的降解能力
        2.2.7 簡并引物設計
        2.2.8 進化樹構建
        2.2.9 總RNA提取
        2.2.10 反轉錄PCR (RT-PCR)
        2.2.11 P. putida S16電轉感受態(tài)細胞制備
        2.2.12 P. putida S16基因敲除菌株構建
    2.3 結果與討論
        2.3.1 簡并引物擴增尼古丁代謝下游基因（簇）
            2.3.1.1 P. putida S16休止細胞降解 2,5-DHP
            2.3.1.2 設計簡并引物
            2.3.1.3 摸索簡并引物PCR擴增的退火溫度
            2.3.1.4 簡并引物PCR擴增可能的目的基因
            2.3.1.5 簡并引物PCR產(chǎn)物的克隆及測序鑒定
            2.3.1.6 構建hpo基因的重組表達質粒
            2.3.1.7 hpo基因功能初步探索
            2.3.1.8 定位尼古丁下游代謝基因簇nic2
        2.3.2 nic2基因簇生物信息學分析
        2.3.3 代謝物對nic基因簇各基因轉錄的影響
        2.3.4 nic2基因簇在尼古丁代謝中的關鍵作用
            2.3.4.1 檢測P. putida S16能否降解煙酸
            2.3.4.2 構建P. putida S16基因敲除突變株
            2.3.4.3 各基因敲除菌株的尼古丁代謝能力
    2.4 本章小結
第三章 2,5-二羥基吡啶雙加氧酶（Hpo和NicX）的性質研究
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 儀器、試劑和緩沖液
        3.2.2 菌株、質粒和引物
        3.2.3 培養(yǎng)基及菌株培養(yǎng)條件
        3.2.4 分子生物學操作
        3.2.5 外源蛋白的誘導表達
        3.2.6 粗酶液制備
        3.2.7 帶His標簽蛋白的親和純化
        3.2.8 不帶標簽Hpo的純化
        3.2.9 蛋白濃度測定
        3.2.10 Hpo定點突變
        3.2.11 酶活性檢測
        3.2.12 酶動力學參數(shù)確定
        3.2.13 凝膠層析確定活性蛋白大小
        3.2.14 O_2消耗檢測
        3.2.15 ~(18)O標記實驗
        3.2.16 非血紅素Fe~(2+)依賴型雙加氧酶進化樹分析
        3.2.17 Hpo保守序列分析
        3.2.18 Hpo及其突變體Fe~(2+)結合比例測定
        3.2.19 Hpo底物特異性檢測
        3.2.20 蛋白結構預測
        3.2.21 蛋白二級結構含量分析
        3.2.22 檢測技術
    3.3 結果與討論
        3.3.1 His-Hpo的誘導、表達和純化
        3.3.2 His-Hpo的酶學性質
            3.3.2.1 His-Hpo的聚合狀態(tài)
            3.3.2.2 pH對His-Hpo酶活的影響
            3.3.2.3 溫度對His-Hpo酶活的影響
            3.3.2.4 金屬離子對His-Hpo酶活的影響
            3.3.2.5 His-Hpo的酶動力學參數(shù)
        3.3.3 無外源氨基酸的Hpo的表達純化
        3.3.4 Hpo與His-Hpo的性質比較
            3.3.4.1 Hpo的聚合狀態(tài)
            3.3.4.2 pH、溫度和金屬離子對Hpo酶活的影響
            3.3.4.3 Hpo的酶動力學參數(shù)
            3.3.4.4 總結比較
        3.3.5 Hpo的酶學性質
            3.3.5.1 Hpo催化反應中的O_2消耗
            3.3.5.2 Hpo催化反應產(chǎn)物中的O原子來源
            3.3.5.3 Hpo的底物特異性
            3.3.5.4 Hpo的氨基肽酶活性
            3.3.5.5 Hpo的去甲酰酶活性
        3.3.6 Hpo三維結構預測
        3.3.7 Hpo定點突變
            3.3.7.1 Hpo點突變體的表達純化
            3.3.7.2 Hpo點突變體的 2,5-DHP雙加氧酶活性
            3.3.7.3 Hpo及其點突變體的Fe~(2+)結合能力
            3.3.7.4 Hpo及其點突變體的二級結構
        3.3.8 Hpo與NicX結構與性質比較
            3.3.8.1 Hpo與NicX的結構比較
            3.3.8.2 Hpo與NicX的催化活性比較
            3.3.8.3 Hpo與NicX的酶動力學參數(shù)比較
    3.4 本章小結
第四章 NFM去甲酰酶和馬來酰胺酸酰胺酶的性質研究
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 儀器、試劑和緩沖液
        4.2.2 菌株、質粒和引物
        4.2.3 培養(yǎng)基及菌株培養(yǎng)條件
        4.2.4 分子生物學操作
        4.2.5 蛋白的誘導表達、純化及濃度測定
        4.2.6 酶活性檢測
        4.2.7 序列比對
        4.2.8 蛋白結構預測
        4.2.9 檢測技術
    4.3 結果與討論
        4.3.1 nfo和ami基因的表達菌株構建
        4.3.2 His-Nfo蛋白的純化
        4.3.3 His-Nfo的酶學性質
            4.3.3.1 His-Nfo催化NFM去甲�；蒆COOH
            4.3.3.2 His-Nfo催化NFM去甲�；神R來酰胺酸
            4.3.3.3 His-Nfo催化NFF的去甲�；�
            4.3.3.4 His-Nfo催化NFM和NFF水解的動力學參數(shù)
        4.3.4 Nfo的結構預測
        4.3.5 His-Ami蛋白的純化
        4.3.6 His-Ami蛋白的酶活檢測
    4.4 本章小結
第五章 尼古丁代謝節(jié)桿菌M2012083比較基因組分析
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 菌株M2012083的來源與保藏
        5.2.2 菌株M2012083的培養(yǎng)
        5.2.3 菌株M2012083基因組提取
        5.2.4 16S rDNA進化樹構建
        5.2.5 菌株鑒定
        5.2.6 基因組測序及組裝
        5.2.7 基因組注釋
        5.2.8 比較基因組分析
    5.3 結果與討論
        5.3.1 菌株M2012083的鑒定
        5.3.2 節(jié)桿菌M2012083的基因組信息
        5.3.3 七株節(jié)桿菌的基因組比較
        5.3.4 節(jié)桿菌M2012083中尼古丁代謝相關基因
        5.3.5 節(jié)桿菌M2012083中壓力應答相關基因
            5.3.5.1 滲透壓力應答
            5.3.5.2 氧化壓力應答
            5.3.5.3 冷或熱激應答
            5.3.5.4 脫毒作用
            5.3.5.5 其他壓力應答蛋白
    5.4 本章小結
結論與展望
創(chuàng)新點
參考文獻
附錄I 儀器設備
附錄II 主要試劑
附錄III 緩沖液
附錄IV 菌株及質粒
附錄V 引物信息
附錄VI 標準曲線
附錄VII 七株節(jié)桿菌中的壓力應答蛋白
致謝
攻讀博士期間（待）發(fā)表論文及所獲獎勵



本文編號：3679833