本文關(guān)鍵詞：葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶的異源表達(dá)及雙酶聯(lián)合降解蘇丹染料方法的開發(fā)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：葡萄糖氧化酶與辣根過氧化酶在食品、醫(yī)藥、化學(xué)檢測(cè)等許多領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用,但是辣根過氧化物酶主要來源于植物,其提取、分離和純化工藝復(fù)雜且成本高,而里氏木霉和畢赤酵母都是優(yōu)良的異源表達(dá)真核宿主,適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。本課題試圖在里氏木霉和畢赤酵母中進(jìn)行葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶的異源表達(dá),同時(shí)對(duì)兩個(gè)酶進(jìn)行雙酶聯(lián)合降解有毒染料的研究。為獲得兩種酶以及聯(lián)合降解有毒染料功能的開發(fā),本文從以下三方面進(jìn)行了研究。一、通過數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘,獲得兩個(gè)酶基因并分別在里氏木霉及畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)。其中在表達(dá)葡萄糖氧化酶的里氏木霉重組菌株plcs-ClGo和表達(dá)辣根過氧化物酶的里氏木霉重組菌株plsl-Prx所產(chǎn)酶液中酶活很低。而畢赤酵母重組菌株pPIC9K-Go所產(chǎn)酶液中葡萄糖氧化酶酶活為74.3 IU/mL;畢赤酵母重組菌株pPIC9K-Prx所產(chǎn)酶液中辣根過氧化物酶酶活為267.3 IU/L。二、為進(jìn)一步對(duì)葡萄糖氧化酶及辣根過氧化物酶功能開發(fā),基于合成生物學(xué)理念,將葡萄糖氧化酶與β-葡萄糖苷酶進(jìn)行融合表達(dá)以擴(kuò)增其底物譜,獲得的最佳重組菌株pPIC9K-GH4B,其所表達(dá)的葡萄糖氧化酶與β-葡萄糖苷酶酶活最大,分別為16.4 IU/mL和0.77 IU/mL;同時(shí)將葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶進(jìn)行共表達(dá),獲得最佳重組菌株pPIC9K-PEVG,得到的葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶酶活分別為20.9 IU/mL和254 IU/L。三、將葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶作用于蘇丹染料的降解,研究發(fā)現(xiàn)在pH6.0的條件下,加入適量酚類物質(zhì)能夠提高對(duì)蘇丹Ⅰ進(jìn)行降解,20μM雙酚A條件下,降解率從21.93%提升到87.5%,另外對(duì)于蘇丹Ⅱ和蘇丹Ⅲ進(jìn)行降解,降解率分別從0提升到58.3%和68.75%。雙酶聯(lián)合降解法利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖緩慢釋放過氧化氫,減少了過氧化氫對(duì)過氧化物酶的傷害,延長(zhǎng)酶的的使用時(shí)長(zhǎng)。通過加入酚類中間物提升了降解的效率,開發(fā)出適用于非堿性天然弱酸性pH值條件下,高效降解蘇丹類有毒染料的方案,為毒害物質(zhì)降解提供了一個(gè)新的思路。
【關(guān)鍵詞】：葡萄糖氧化酶 辣根過氧化物酶 異源表達(dá) 蘇丹降解
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：X172;Q814.9
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 背景10-17
• 1.1 葡萄糖氧化酶10-11
• 1.1.1 葡萄糖氧化酶概述10
• 1.1.2 葡萄糖氧化酶的催化反應(yīng)機(jī)制10-11
• 1.1.3 葡萄糖氧化酶的來源及應(yīng)用11
• 1.2 辣根過氧化物酶11-13
• 1.2.1 辣根過氧化物酶概述11-12
• 1.2.2 辣根過氧化物酶催化反應(yīng)機(jī)制12
• 1.2.3 辣根過氧化物酶對(duì)毒害物質(zhì)的降解12-13
• 1.3 表達(dá)系統(tǒng)13-16
• 1.3.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)13-15
• 1.3.2 里氏木霉表達(dá)系統(tǒng)15-16
• 1.4 本文主要研究?jī)?nèi)容16-17
• 第2章 材料與方法17-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17-24
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒17
• 2.1.2 主要培養(yǎng)基配方17-20
• 2.1.3 主要試劑配制20-21
• 2.1.4 引物序列21-22
• 2.1.5 主要試劑22-23
• 2.1.6 主要儀器設(shè)備23-24
• 2.1.7 實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)軟件24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-32
• 2.2.1 常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作24-26
• 2.2.2 里氏木霉結(jié)合轉(zhuǎn)移26-28
• 2.2.3 畢赤酵母轉(zhuǎn)化28-30
• 2.2.4 酶活測(cè)定30-32
• 第3章 葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶分別在里氏木霉中表達(dá)32-38
• 3.1 方法與步驟32-35
• 3.1.1 酶基因的獲得32-34
• 3.1.2 重組里氏木霉的構(gòu)建34-35
• 3.1.3 重組菌株的發(fā)酵以及產(chǎn)物的酶活測(cè)定35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論35-37
• 3.2.1 重組里氏木霉的構(gòu)建35-36
• 3.2.2 酶活分析36-37
• 3.3 小結(jié)37-38
• 第4章 葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶在畢赤酵母中表達(dá)38-49
• 4.1 方法與步驟38-40
• 4.1.1 重組畢赤酵母的構(gòu)建38-40
• 4.1.2 重組菌株的發(fā)酵以及產(chǎn)物的酶活測(cè)定以及酶學(xué)性質(zhì)分析40
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論40-47
• 4.2.1 重組畢赤酵母的構(gòu)建40-43
• 4.2.2 重組畢赤酵母的發(fā)酵43-44
• 4.2.3 酶活分析44-47
• 4.3 小結(jié)47-49
• 第5章 酶降解蘇丹染料49-66
• 5.1 方法與步驟49-52
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑的配置49-50
• 5.1.2 不同酚類物質(zhì)對(duì)蘇丹染料降解的影響50
• 5.1.3 底物及產(chǎn)物的檢測(cè)50-51
• 5.1.4 GOD、HRP濃度,葡萄糖濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)蘇丹染料降解的影響51
• 5.1.5 溫度,pH對(duì)蘇丹染料降解的影響51
• 5.1.6 酶偶聯(lián)反應(yīng)對(duì)蘇丹染料降解的影響51-52
• 5.1.7 發(fā)酵液對(duì)蘇丹Ⅰ染料降解52
• 5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論52-64
• 5.2.1 試劑的配置52
• 5.2.2 不同酚類物質(zhì)對(duì)蘇丹染料降解的影響52-58
• 5.2.3 GOD、HRP濃度,葡萄糖濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)蘇丹染料降解的影響58-60
• 5.2.4 溫度,pH對(duì)蘇丹染料降解的影響60-61
• 5.2.5 酶偶聯(lián)反應(yīng)對(duì)蘇丹染料降解的影響61-64
• 5.2.6 發(fā)酵液對(duì)蘇丹Ⅰ染料降解64
• 5.3 小結(jié)64-66
• 第6章 結(jié)論與展望66-67
• 6.1 全文總結(jié)66
• 6.2 展望66-67
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 致謝72-73
• 碩士期間發(fā)表論文73

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 馬清河,胡常英,劉麗娜,唐兆宏,王云鵬;葡萄糖氧化酶在果汁保鮮中的應(yīng)用[J];中國(guó)食品添加劑;2005年03期

2 張廣棟,羅倉(cāng)學(xué);生物傳感器及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J];食品研究與開發(fā);2005年01期

  本文關(guān)鍵詞：葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶的異源表達(dá)及雙酶聯(lián)合降解蘇丹染料方法的開發(fā)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：359100