Dietzia菌隨機(jī)插入突變體文庫(kù)的構(gòu)建及功能基因篩選
發(fā)布時(shí)間：2022-01-14 07:34
Dietzia屬菌具有很好的烴類降解和良好的高鹽、高堿耐受能力.為研究Dietzia屬降解烷烴和耐受鹽堿的分子機(jī)制,以Dietzia sp. DQ12-45-1b為研究菌株,利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)p Tip-istAB-sacB和pRTSK-sacB,成功構(gòu)建庫(kù)容為30 720的隨機(jī)突變體文庫(kù).隨機(jī)挑選的突變克隆及突變克隆傳代20次后的Southern blot結(jié)果表明:轉(zhuǎn)座序列插入的隨機(jī)性較好,均為單插入突變,并且具有較好的遺傳穩(wěn)定性,可用于長(zhǎng)期篩選功能基因.在此基礎(chǔ)上,分別以高鹽培養(yǎng)和正十六烷為單一碳源培養(yǎng),利用高通量基因篩選,成功獲得了一個(gè)耐鹽突變體M9G和5個(gè)降解利用正十六烷相關(guān)突變株M6A、M6B、M7A、M9A、M81C.與野生型相比,5個(gè)降解利用正十六烷相關(guān)突變株的降解率下降范圍為16.67%-84.35%.插入位點(diǎn)分析結(jié)果顯示,M9G、M6A、M6B、M7A、M9A和M81C的插入基因分別預(yù)測(cè)為絲氨酸蛋白酶、鐵氧化還原蛋白、假定蛋白、鐵氧化還原蛋白還原酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞色素P450類CYP153烷烴羥化酶.其中除了預(yù)測(cè)假定蛋白外,有些基因與傳統(tǒng)上確定的功能存在差異,暗示著...
【文章來(lái)源】：應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào). 2020,26(04)北大核心CSCD
【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)
【部分圖文】：
DQ12-45-1b突變株基因組中轉(zhuǎn)座子PCR擴(kuò)增.1-9:DQ12-45-1b突變體庫(kù)隨機(jī)挑選的9株突變株；10:pRTSK-sacB;11:DQ12-45-1b（野生型菌株）；M:DNA maker(DL 5000).
為驗(yàn)證DQ12-45-1b隨機(jī)突變體文庫(kù)的構(gòu)建質(zhì)量，我們主要考察了插入隨機(jī)性、插入拷貝數(shù)和傳代穩(wěn)定性.為驗(yàn)證插入的隨機(jī)性和單一性，隨機(jī)挑選了9個(gè)突變株克隆經(jīng)Bam H I酶切后，進(jìn)行Southern blot雜交檢測(cè).結(jié)果（圖2）表明，各突變株得到的雜交條帶大小不一，說(shuō)明了轉(zhuǎn)座序列插入到了不同的位點(diǎn)，證明轉(zhuǎn)座插入的隨機(jī)性較好；同時(shí)各泳道均只有一條單一條帶，表明9個(gè)突變體均為單一位點(diǎn)插入突變，突變體插入拷貝數(shù)為1的概率較高（圖2A）.為驗(yàn)證突變體的傳代穩(wěn)定性，隨機(jī)挑選的9個(gè)突變株傳代20次后，再次進(jìn)行Southern blot雜交試驗(yàn)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)座序列插入基因組后不會(huì)丟失，可用于長(zhǎng)期篩選功能基因，表明該突變文庫(kù)具有較好的遺傳穩(wěn)定性（圖2B).2.3 耐鹽基因的篩選和鑒定
以野生型DQ12-45-1b菌株為平行對(duì)照，將M9G突變株分別接種于不含NaCl的正常GPY液體培養(yǎng)基和含100 g/L NaCl的高鹽GPY液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察期生長(zhǎng)情況.結(jié)果表明：在正常GPY培養(yǎng)基中，M9G與野生型菌株生長(zhǎng)狀態(tài)沒有顯著差異；但在高鹽GPY培養(yǎng)基中，M9G的生長(zhǎng)情況顯著弱于野生型菌株（圖3），證明了M9G中與其耐鹽相關(guān)基因被插入失活.提取M9G突變株全基因組DNA，通過(guò)酶切、自環(huán)化后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒，測(cè)序，進(jìn)行轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)鑒定.結(jié)果表明：在M9G中，轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)在Contig46-orf03606的-239 bp處.通過(guò)KEGG和SWISS等數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，Contig46-orf03606編碼絲氨酸蛋白酶（Serine protease）；通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)Contig46-orf03606與Dietzia sp.UCD-THP中編碼Do/DeqQ家族絲氨酸蛋白酶基因序列具有最高的相似性，達(dá)到99%.系統(tǒng)發(fā)育分析也表明Contig46-orf03606與Dietzia菌的相關(guān)序列聚為一簇（圖4A).Do/DeqQ家族的絲氨酸蛋白酶位于胞內(nèi)，具有蛋白酶和分子伴侶的雙重功能.在正常溫度下，其行駛分子伴侶的功能，幫助蛋白正確折疊.在高溫狀態(tài)下，其主要功能是幫助水解錯(cuò)誤折疊的蛋白分子[26].但以前還沒有關(guān)于絲氨酸蛋白酶與耐鹽相關(guān)的報(bào)道.有研究表明，在高鹽條件下，細(xì)胞內(nèi)通常會(huì)發(fā)生蛋白失活和聚集、以及蛋白合成速率降低[27]，這需要絲氨酸蛋白酶來(lái)發(fā)揮維持正常折疊和合成過(guò)程的功能，保證細(xì)胞進(jìn)行正常的生命活動(dòng)過(guò)程.為此，我們推測(cè)Contig46-orf03606編碼的絲氨酸蛋白酶失活，將無(wú)法維持在鹽脅迫下細(xì)胞內(nèi)功能蛋白的正常折疊和合成過(guò)程，無(wú)法保證細(xì)胞內(nèi)合成更多的功能蛋白，使其能夠快速調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透平衡，從而獲得較強(qiáng)的耐鹽脅迫能力.
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]細(xì)菌Dietzia sp.DQ12-45-1b中兩種長(zhǎng)鏈烷烴羥化酶基因的鑒定[J]. 馬冬玲,聶勇,吳曉磊,劉立明. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào). 2015(05)
[2]水稻插入突變庫(kù)構(gòu)建研究進(jìn)展[J]. 閻雙勇,譚振波,李仕貴. 中國(guó)生物工程雜志. 2004(06)
本文編號(hào)：3588095
【文章來(lái)源】：應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào). 2020,26(04)北大核心CSCD
【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)
【部分圖文】：
DQ12-45-1b突變株基因組中轉(zhuǎn)座子PCR擴(kuò)增.1-9:DQ12-45-1b突變體庫(kù)隨機(jī)挑選的9株突變株；10:pRTSK-sacB;11:DQ12-45-1b（野生型菌株）；M:DNA maker(DL 5000).
為驗(yàn)證DQ12-45-1b隨機(jī)突變體文庫(kù)的構(gòu)建質(zhì)量，我們主要考察了插入隨機(jī)性、插入拷貝數(shù)和傳代穩(wěn)定性.為驗(yàn)證插入的隨機(jī)性和單一性，隨機(jī)挑選了9個(gè)突變株克隆經(jīng)Bam H I酶切后，進(jìn)行Southern blot雜交檢測(cè).結(jié)果（圖2）表明，各突變株得到的雜交條帶大小不一，說(shuō)明了轉(zhuǎn)座序列插入到了不同的位點(diǎn)，證明轉(zhuǎn)座插入的隨機(jī)性較好；同時(shí)各泳道均只有一條單一條帶，表明9個(gè)突變體均為單一位點(diǎn)插入突變，突變體插入拷貝數(shù)為1的概率較高（圖2A）.為驗(yàn)證突變體的傳代穩(wěn)定性，隨機(jī)挑選的9個(gè)突變株傳代20次后，再次進(jìn)行Southern blot雜交試驗(yàn)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)座序列插入基因組后不會(huì)丟失，可用于長(zhǎng)期篩選功能基因，表明該突變文庫(kù)具有較好的遺傳穩(wěn)定性（圖2B).2.3 耐鹽基因的篩選和鑒定
以野生型DQ12-45-1b菌株為平行對(duì)照，將M9G突變株分別接種于不含NaCl的正常GPY液體培養(yǎng)基和含100 g/L NaCl的高鹽GPY液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察期生長(zhǎng)情況.結(jié)果表明：在正常GPY培養(yǎng)基中，M9G與野生型菌株生長(zhǎng)狀態(tài)沒有顯著差異；但在高鹽GPY培養(yǎng)基中，M9G的生長(zhǎng)情況顯著弱于野生型菌株（圖3），證明了M9G中與其耐鹽相關(guān)基因被插入失活.提取M9G突變株全基因組DNA，通過(guò)酶切、自環(huán)化后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒，測(cè)序，進(jìn)行轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)鑒定.結(jié)果表明：在M9G中，轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)在Contig46-orf03606的-239 bp處.通過(guò)KEGG和SWISS等數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，Contig46-orf03606編碼絲氨酸蛋白酶（Serine protease）；通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)Contig46-orf03606與Dietzia sp.UCD-THP中編碼Do/DeqQ家族絲氨酸蛋白酶基因序列具有最高的相似性，達(dá)到99%.系統(tǒng)發(fā)育分析也表明Contig46-orf03606與Dietzia菌的相關(guān)序列聚為一簇（圖4A).Do/DeqQ家族的絲氨酸蛋白酶位于胞內(nèi)，具有蛋白酶和分子伴侶的雙重功能.在正常溫度下，其行駛分子伴侶的功能，幫助蛋白正確折疊.在高溫狀態(tài)下，其主要功能是幫助水解錯(cuò)誤折疊的蛋白分子[26].但以前還沒有關(guān)于絲氨酸蛋白酶與耐鹽相關(guān)的報(bào)道.有研究表明，在高鹽條件下，細(xì)胞內(nèi)通常會(huì)發(fā)生蛋白失活和聚集、以及蛋白合成速率降低[27]，這需要絲氨酸蛋白酶來(lái)發(fā)揮維持正常折疊和合成過(guò)程的功能，保證細(xì)胞進(jìn)行正常的生命活動(dòng)過(guò)程.為此，我們推測(cè)Contig46-orf03606編碼的絲氨酸蛋白酶失活，將無(wú)法維持在鹽脅迫下細(xì)胞內(nèi)功能蛋白的正常折疊和合成過(guò)程，無(wú)法保證細(xì)胞內(nèi)合成更多的功能蛋白，使其能夠快速調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透平衡，從而獲得較強(qiáng)的耐鹽脅迫能力.
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]細(xì)菌Dietzia sp.DQ12-45-1b中兩種長(zhǎng)鏈烷烴羥化酶基因的鑒定[J]. 馬冬玲,聶勇,吳曉磊,劉立明. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào). 2015(05)
[2]水稻插入突變庫(kù)構(gòu)建研究進(jìn)展[J]. 閻雙勇,譚振波,李仕貴. 中國(guó)生物工程雜志. 2004(06)
本文編號(hào)：3588095
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