自二十世紀(jì)五十年代以來，有機磷化合物已被廣泛地用于農(nóng)用殺蟲劑。由于有機磷化合物能不可逆抑制動物神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿酯酶，破壞神經(jīng)傳遞，因此對人及家畜等脊椎動物具有極強的毒副作用。由于殺蟲劑的過量和連續(xù)使用，許多地區(qū)土地、水生態(tài)系統(tǒng)被有機磷化合物污染，對人類健康構(gòu)成巨大威脅。目前去除有機磷污染物的方法（漂白處理、堿水解、焚燒或填埋處理等）反應(yīng)條件劇烈、副產(chǎn)物具有毒性及腐蝕性，限制了廣泛應(yīng)用。微生物來源的磷酸三酯酶（PTE, EC3.1.8.1）可以廣泛水解有機磷殺蟲劑，具有環(huán)保和原位解毒優(yōu)勢，提供了生物修復(fù)新途徑。由于磷酸三酯酶均來源于常溫微生物，較低的生物學(xué)穩(wěn)定性限制了其實際應(yīng)用。因此，應(yīng)用生物技術(shù)手段，研發(fā)生物學(xué)穩(wěn)定性好、廣譜、高效的有機磷殺蟲劑降解酶勢在必行。通過檢索細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)嗜熱細(xì)菌Geobacillus kaustophilus HTA426基因組DNA中含有一個磷酸三酯酶（命名為GkaP）編碼序列GK1506（GenBank ID:3183579），我們對該基因進行了異源表達，并對重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)、催化機制及分子進化等方面開展了系統(tǒng)研究。重組GkaP具有優(yōu)異... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

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摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 有機磷化合物及其神經(jīng)毒性
    1.2 細(xì)菌磷酸三酯酶
        1.2.1 底物特異性和立體選擇性
        1.2.2 X-ray 結(jié)構(gòu)
        1.2.3 催化機理
        1.2.4 磷酸三酯酶的潛在應(yīng)用
    1.3 磷酸三酯酶的趨異進化
    1.4 蛋白質(zhì)工程簡介
        1.4.1 蛋白質(zhì)的理性設(shè)計
            1.4.1.1 底物特異性與立體選擇性的改造
            1.4.1.2 活力改造
            1.4.1.3 穩(wěn)定性改造
            1.4.1.4 酶分子結(jié)構(gòu)元件嫁接
        1.4.2 蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計
            1.4.2.1 易錯 PCR (error-prone PCR)
            1.4.2.2 同源基因重組 (homology-dependent gene recombination)
        1.4.3 蛋白質(zhì)的半理性設(shè)計
            1.4.3.1 特定區(qū)域的隨機突變
            1.4.3.2 隨機突變后的定點飽和突變
            1.4.3.3 計算機輔助的半理性設(shè)計
    1.5 分子進化類磷酸三酯的酶內(nèi)酯酶
    1.6 其它有機磷水解酶類
        1.6.1 二異丙基氟磷酸酯酶 (diisopropylfluorophosphatase, DFPases)
        1.6.2 血清對氧磷酶 (Serum paraoxonase, PON)
        1.6.3 有機磷酸酸酐水解酶 (Organophosphorus acid anhydrolase, OPAA)
        1.6.4 甲基對硫磷水解酶 (Methyl parathion hydrolase, MPH)
    1.7 立題依據(jù)和實驗設(shè)計
    1.8 參考文獻
第二章 嗜熱磷酸三酯酶基因的克隆、表達及工程菌構(gòu)建
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 主要儀器
        2.2.4 培養(yǎng)基
        2.2.5 使用的數(shù)據(jù)庫及軟件
    2.3 實驗方法
        2.3.1 Geobacillus kaustophilus HTA426 的復(fù)蘇及培養(yǎng)
        2.3.2 G. kaustophilus HTA426 基因組 DNA 的提取
        2.3.3 來源于嗜熱細(xì)菌 G. kaustophilus HTA426 的磷酸三酯酶基因的克隆
            2.3.3.1 引物設(shè)計
            2.3.3.2 GK1506 基因的 PCR 擴增
            2.3.3.3 GK1506 的酶切和純化
            2.3.3.4 pET-28a 載體制備
            2.3.3.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.3.3.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.3.3.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.3.3.8 陽性克隆的篩選及鑒定
        2.3.4 GK1506 基因的預(yù)表達
        2.3.5 GkaP 的分離純化
        2.3.6 蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 同源序列比對及進化關(guān)系分析
        2.4.2 磷酸三酯酶 GK1506 基因的 PCR 擴增
        2.4.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定
        2.4.4 目的蛋白的表達和純化
    2.5 小結(jié)
    2.6 參考文獻
第三章 GkaP 的酶學(xué)性質(zhì)
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 酶活力測定方法
            3.2.2.1 磷酸三酯酶活力測定方法
            3.2.2.2 內(nèi)酯酶活力測定方法
            3.2.2.3 羧酸酯酶活力測定方法
        3.2.3 最適溫度和熱穩(wěn)定性測定
        3.2.4 最適 pH 和 pH 穩(wěn)定性測定
        3.2.5 動力學(xué)常數(shù)的測定
        3.2.6 不同的二價金屬離子取代對酶活性的影響
        3.2.7 金屬螯合劑、有機溶劑及去污劑對 GkaP 活力的影響
        3.2.8 蛋白的金屬含量測定
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 GkaP 的最適溫度和熱穩(wěn)定性
        3.3.2 GkaP 的最適 pH 和 pH 穩(wěn)定性
        3.3.3 GkaP 的催化“非專一性”
        3.3.4 不同的二價離子構(gòu)建的 GkaP 對酶活力的影響
        3.3.5 GkaP 的金屬含量分析
        3.3.6 金屬螯合劑、有機溶劑及去污劑對 GkaP 活力的影響
    3.4 小結(jié)
    3.5 參考文獻
第四章 GkaP 活性中心附近熱點氨基酸的突變體設(shè)計與功能研究
    4.1 引言
    4.2 實驗方法
        4.2.1 同源序列比對
        4.2.2 定點突變和定點飽和突變
        4.2.3 飽和突變庫的篩選
        4.2.4 野生型 GkaP 及其突變體的表達、純化
        4.2.5 動力學(xué)常數(shù)測定
        4.2.6 野生型 GkaP 及其突變體對各種殺蟲劑的比活力測定
        4.2.7 底物的分子對接
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 GkaP 的 Tyr~(99)和 Arg~(230)位點飽和突變庫的構(gòu)建和篩選
        4.3.2 突變體的動力學(xué)常數(shù)分析
        4.3.3 突變體對于幾種有機磷殺蟲劑的比活力
        4.3.4 GkaP 突變體活力變化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
    4.4 小結(jié)
    4.5 參考文獻
第五章 GkaP 的分子進化—提高對有機磷殺蟲劑的降解活力
    5.1 引言
    5.2 實驗方法
        5.2.1 定點突變和定點飽和突變
        5.2.2 全基因易錯 PCR 突變庫的構(gòu)建
        5.2.3 突變庫篩選
        5.2.4 突變體的表達和純化
        5.2.5 動力學(xué)常數(shù)和各種殺蟲劑比活力測定方法
        5.2.6 突變體的熱穩(wěn)定性、最適溫度和 pH 測定
        5.2.7 突變體的同源建模
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 GkaP 的進化策略
        5.3.2 突變體的動力學(xué)常數(shù)分析
        5.3.3 突變體的熱穩(wěn)定性分析
        5.3.4 突變體的生化性質(zhì)表征 (最適溫度和最適 pH)
        5.3.5 突變體對不同有機磷殺蟲劑的比活力
        5.3.6 突變位點的結(jié)構(gòu)分析
    5.4 小結(jié)
    5.5 參考文獻
創(chuàng)新點
展望
作者簡歷
攻讀博士期間發(fā)表成果
參與的科研課題
致謝



本文編號：3260145