鎘（Cadmium, Cd）是主要的重金屬污染元素,水稻（Oryza sativa）是重要的糧食作物。Cd嚴重影響水稻的生長和產量,并危害人體健康。microRNA （miRNA）是一類新型的調控基因表達的小分子RNA,它對植物生長發(fā)育以及多種逆境脅迫響應的調節(jié)發(fā)揮著重要作用。研究miRNA在水稻重金屬Cd脅迫應答過程中的功能,將有助于加強對基因表達調控機制和植物重金屬耐性分子機理的理解,也可為通過小分子RNA的遺傳操作改良作物的抗逆性提供新思路。本研究以粳稻中花11為材料,利用miRNA微陣列芯片和熒光定量PCR技術篩選、驗證得到了19個與Cd脅迫應答相關的miRNA。miR528在Cd脅迫下表達顯著上調,miRl66、miR171、miRl68、miR162、miR396、miR390、miR156、miR1432和miR444b.1等的表達則受到顯著抑制。對Cd脅迫下差異表達的miRNA的靶基因進行生物信息學預測,發(fā)現這些靶基因多為調節(jié)性基因,包括調控下游基因表達的轉錄因子,參與信號轉導的蛋白激酶和鈣調素結合蛋白等。它們參與調控植物的生長發(fā)育、信號轉導以及多種脅迫反應。并從中選取... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 植物miRNA
        1.1 植物miRNA的生物合成
        1.2 植物體內miRNA的鑒定及表達分析
            1.2.1 克隆與高通量測序
            1.2.2 生物信息學預測
            1.2.3 遺傳學篩選
            1.2.4 miRNA表達量分析
        1.3 植物miRNA靶基因的識別和鑒定
        1.4 植物體內miRNA的功能
            1.4.1 miRNA參與植物生長發(fā)育調控
            1.4.2 miRNA參與激素調節(jié)與信號轉導
            1.4.3 miRNA參與植物逆境脅迫應答
                1.4.3.1 抗環(huán)境脅迫
                1.4.3.2 抗營養(yǎng)脅迫
                1.4.3.3 抗生物脅迫
    2 Cd毒害與植物
        2.1 Cd對植物的毒害作用
            2.1.1 Cd影響植物生長
            2.1.2 Cd影響水分吸收和營養(yǎng)平衡
            2.1.3 Cd影響呼吸作用
            2.1.4 Cd影響光合作用
            2.1.5 Cd導致氧化脅迫
        2.2 植物對Cd的耐受作用
            2.2.1 限制Cd進入植物體內
            2.2.2 Cd的螯合和區(qū)室化
            2.2.3 激活植物體內抗氧化防御系統(tǒng)
            2.2.4 誘導脅迫蛋白
    3 miRNA在重金屬脅迫應答中的作用
        3.1 miR398與重金屬脅迫
        3.2 非必需重金屬脅迫相關的miRNA
    4 研究目的和意義
第二章 Cd脅迫相關miRNA的分離與鑒定
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 試驗方法
            1.2.1 水稻幼苗的培養(yǎng)
            1.2.2 Cd脅迫處理
            1.2.3 水稻根總RNA的提取
            1.2.4 miRNA芯片實驗
            1.2.5 實時定量PCR檢測miRNA表達
            1.2.6 半定量RT-PCR檢測miRNA前體的表達
            1.2.7 miRNA基因上游啟動子的確定以及順式作用元件分析
    2 結果與分析
        2.1 miRNA芯片分離獲得19個Cd脅迫相關的miRNA
        2.2 熒光定量PCR和半定量RT-PCR驗證miRNA芯片結果
        2.3 miRNA基因上游脅迫相關順式作用元件預測與重金屬響應元件分析
    3 小結與討論
        3.1 miRNA微陣列芯片鑒定Cd脅迫相關miRNA的優(yōu)缺點
        3.2 Cd脅迫相關miRNA種類
        3.3 Cd脅迫相關miRNA的順式作用元件分析與討論
第三章 Cd脅迫相關miRNA靶基因的預測與表達分析
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 試驗方法
            1.2.1 生物信息學方法預測miRNA的靶基因
            1.2.2 實時定量PCR檢測miRNA靶基因的表達
    2 結果與分析
        2.1 Cd脅迫相關miRNA的靶基因預測分析
            2.1.1 轉錄因子
            2.1.2 蛋白激酶
            2.1.3 鈣信號分子
            2.1.4 miRNA生物加工或作用中的重要蛋白
        2.2 Cd脅迫相關miRNA的靶基因的表達水平檢測
    3 討論
        3.1 miRNA同時參與植物的生長發(fā)育和脅迫應答的調控
        3.2 miRNA調控靶基因的復雜性
    4 本章小結
第四章 過表達miR166對水稻Cd脅迫耐受性的影響研究
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 試驗試劑
        1.3 miRNA過表達載體(35S：MIRNA)的構建
            1.3.1 克隆引物設計
            1.3.2 載體構建流程
        1.4 農桿菌轉化及農桿菌介導的水稻轉基因
            1.4.1 農桿菌感受態(tài)的制備與轉化
            1.4.2 農桿菌介導的水稻轉基因
        1.5 轉基因陽性植株的鑒定
            1.5.1 葉片潮霉素篩選
            1.5.2 GUS蛋白的組織化學染色
            1.5.3 熒光定量PCR鑒定miRNA及其靶基因的表達
        1.6 轉基因水稻對Cd脅迫的響應
            1.6.1 Hyg抗性遺傳分析
            1.6.2 轉基因水稻植株Cd處理表型觀察
                1.6.2.1 葉綠素含量測定
                1.6.2.2 丙二醛含量測定
                1.6.2.3 H_2O_2含量測定
                1.6.2.4 Cd含量測定
                1.6.2.5 數據分析
            1.6.3 轉基因水稻種子在Cd處理下的萌發(fā)情況
            1.6.4 轉基因水稻干旱處理
    2 結果與分析
        2.1 過表達載體35S：MIR166m的構建及在水稻中的遺傳轉化
        2.2 35S：MIRNA轉基因植株的鑒定
            2.2.1 轉基因水稻的Hyg檢測和GUS組織化學活性分析
            2.2.2 轉基因水稻中miRNA及其靶基因的表達檢測
        2.3
            2.3.2 過表達miR166提高水稻苗期對Cd脅迫的耐受性
            2.3.3 過表達miR166提高水稻對干旱脅迫的耐受性
    3 小結與討論
        3.1 35S：MIRNA過表達載體的構建
        3.2 miR166過表達導致水稻對Cd的耐受性增強
第五章 結論與展望
    1 全文結論
    2 創(chuàng)新之處
    3 研究展望
參考文獻
作者簡歷及攻讀博士學位期間取得的科研成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]高表達擬南芥miR396提高煙草抗旱性（英文）[J]. 楊鳳璽,余迪求.  云南植物研究. 2009(05)
[2]內源小RNAs在植物脅迫反應中的作用[J]. 謝兆輝.  遺傳. 2009(08)
[3]一種檢測microRNA表達的微陣列芯片的研制及應用[J]. 駱明勇,田志剛,徐智,張亮,王應雄,程京.  生物化學與生物物理進展. 2007(01)
[4]植物金屬硫蛋白及其重金屬解毒機制研究進展[J]. 全先慶,張洪濤,單雷,畢玉平.  遺傳. 2006(03)
[5]植物對重金屬鎘的耐受機制[J]. 張軍,束文圣.  植物生理與分子生物學學報. 2006(01)
[6]植物富含亮氨酸重復序列型類受體蛋白激酶的生物學功能[J]. 馬媛媛,甘睿,王寧寧.  植物生理與分子生物學學報. 2005(04)

博士論文
[1]一氧化氮緩解水稻鎘毒害的作用及其生理機制[D]. 熊杰.浙江大學 2009
[2]鎘誘導植物氧化代謝與鈣信使的變化及分子機理[D]. 趙士誠.中國農業(yè)科學院 2008
[3]水稻鎘耐性和積累的基因型差異與機理研究[D]. 邵國勝.浙江大學 2005



本文編號：3252585