進入21世紀,資源與環(huán)境成為影響人類可持續(xù)發(fā)展的突出問題。特別是生物工業(yè)技術產業(yè)形成高附加值產品的同時會產生大量生物質廢棄物,其化學成分復雜,有的存在大量抗生素等環(huán)境有害物質,因此如何高效、高值轉化生物質廢棄物就成為當前生物技術領域研究的熱點問題。微生物在生物質廢棄物的降解過程中發(fā)揮了重要作用,全面系統地篩選、認識并改造相關微生物已成為研究重點。本研究從天然生境中篩選獲得一系列高溫放線菌株。利用整合功能組學方法研究了嗜熱鏈霉菌F-3對生物質廢棄物的降解偏好性,明確了其在菌渣等危險生物質廢棄物轉化過程中的重要作用。為了深入研究功能酶系的作用,克隆表達了該菌6個高溫、耐堿的幾丁質酶組分,利用結構信息組學技術揭示了相關酶系高效協同降解的分子機制;并對其中關鍵的持續(xù)性幾丁質酶SsChi18A的活性架構進行了系統功能分析,初步闡明其高效持續(xù)性作用的分子機制。相關研究為工業(yè)微生物發(fā)酵菌渣等生物質廢棄物的高效高值轉化等奠定了理論基礎。本文取得如下研究成果:1.從生物質廢棄物降解生境中篩選獲得一系列具有高效降解活性的嗜熱放線菌菌株。微生物在生物質廢棄物的轉化過程中發(fā)揮了重要作用。玉米秸稈混合牛糞降解生境中含有豐富的微生物群落,利用宏基因組及宏蛋白質組分析表明,高溫放線菌在其中占據重要地位。經過對生境樣品的篩選和純化,共獲得8株生物質廢棄物降解相關的嗜熱放線菌,分別來自諾卡氏菌屬、擬諾卡氏菌屬、鏈霉菌屬以及喜熱裂孢菌屬,相關菌株的獲得為后繼研究奠定了物質基礎。2.利用整合功能組學方法分析了嗜熱鏈霉菌F-3對生物質廢棄物的降解偏好性。嗜熱鏈霉菌F-3菌株篩選自天然高溫生物質降解生境,其最適生長溫度為50℃。全基因組測序表明,其基因組中含有多種與有機廢棄物降解代謝相關的功能基因和與次級代謝產物合成相關的基因簇。其中編碼木質纖維素降解相關酶類基因有18種,幾丁質降解相關基因有9種,還有71種蛋白酶編碼基因等,這表明其在生物質廢棄物的降解過程有較大潛力。利用多種不同碳源對其進行培養(yǎng),并對其胞外功能酶系的種類、濃度等動態(tài)變化進行系統分析,結果表明胞外酶系中幾丁質酶類及β-1,3-葡聚糖酶高效誘導表達;木質纖維素降解酶類分泌量低,同時胞外還檢測到了大量蛋白酶類表達,特別是在發(fā)酵后期表達量明顯升高,因此鏈霉菌F-3應在天然生境中的生態(tài)位應該是真菌等殘余菌體的高效降解利用者。鏈霉菌F-3降解偏好性的闡明,有助于指導其工業(yè)應用方向。3.以3種工業(yè)微生物發(fā)酵菌渣為底物,利用功能蛋白質組學分析證明了嗜熱鏈霉菌F-3通過分泌多種類和多組分降解酶對生物質廢棄物進行降解轉化。以工業(yè)生產中微生物發(fā)酵剩余的黑曲霉菌渣、酵母菌菌渣及產大觀霉素的鏈霉菌菌渣等生物質廢棄物為底物,分析了鏈霉菌F-3在菌渣降解過程中,功能酶系的變化規(guī)律。結果表明,鏈霉菌F-3可直接利用相關菌渣生長,未受廢棄物中殘余抗生素等物質抑制。三種菌渣的發(fā)酵液中均檢測到4種幾丁質水解酶、2種幾丁質氧化酶以及3種β-1,3-葡聚糖酶組分;這些水解酶來自不同的家族,具有不同的結構域組成。此外,在大觀霉素菌渣中檢測到3種β-N-乙酰己糖苷酶,這些酶組分應參與真菌細胞壁多糖的高效降解轉化。蛋白質組還檢測到14種胞外蛋白酶以及40種胞內蛋白酶的表達,其中S8家族的內切絲氨酸蛋白酶在胞外表達量最高;且5種S8家族蛋白酶活性架構具有不同分子表面性質,其精確識別與結合可高效協同降解蛋白質形成肽片段;另外,胞外還存在大量金屬蛋白酶,可與內切絲氨酸蛋白酶及外切氨肽酶協同降解肽段片段形成小肽及部分氨基酸。大量肽轉運蛋白的確定證實了該鏈霉菌可吸收相關肽段,并通過胞內氨肽酶及頭羧肽酶高效協同的方式快速降解轉化相關肽類。鏈霉菌F-3對工業(yè)生物質廢棄物高效降解利用的潛能分析為其進一步開發(fā)利用奠定了理論基礎。4.從鏈霉菌F-3基因組中克隆表達了 6種高溫、耐堿的幾丁質酶組分,并利用結構信息學技術揭示了相關酶系高效協同降解的分子機制。幾丁質是類似結晶纖維素的一類難降解生物質。嗜熱鏈霉菌F-3具有耐高溫耐堿性的幾丁質降解活性,對其中6種幾丁質降解相關酶組分進行了異源表達,包括3種來自GH18家族幾丁質酶(SsChi18A,SsChi18B和SsChil8C),1種GH19家族的幾丁質酶(SsChi19A),1種GH20家族的β-N-乙酰己糖胺酶(SsGH20A)和1種來自AA10家族的裂解多糖單加氧酶(SsLPMO10A)。生化測定結果表明這些水解酶都可耐受70℃的高溫,并且在pH值為4至1 1時酶活相對穩(wěn)定。產物譜分析表明這些幾丁質降解酶具有不同的降解模式,在幾丁質降解過程中顯示明顯的協同效應�；诮Y構生物信息學分析,GH18幾丁質酶組分不同作用模式可能是由其活性架構中的Loop差異引起的。其中,SsChi18A是持續(xù)性幾丁質酶,主要作用于不溶性幾丁質;而SsChi18B和SsChil8C是內切非持續(xù)性酶類,對幾丁質寡糖的降解顯示出更高活性。此外,蛋白質組學及協同分析也表明氧化酶類SsLPMO10A的重要性,它可增強水解酶降解活性�？偟膩碚f,通過對菌株F-3分泌的多種幾丁質降解酶的功能和生物信息學分析,闡明了其協同高效降解不溶性底物的物質和結構基礎,將為天然幾丁質的高效工業(yè)化轉化準備了功能基因素材。5.通過鏈霉菌F-3幾丁質酶系中關鍵持續(xù)性幾丁質酶SsChi18A的活性架構分析,初步闡明其高效持續(xù)性作用的分子機制。酶分子的持續(xù)性是不溶性結晶底物高效降解的主要保證,因此持續(xù)性幾丁質酶在結晶幾丁質的高效降解過程發(fā)揮了重要作用。序列及結構生物信息學分析表明,持續(xù)性酶活性架構中含有多個保守芳香族氨基酸與帶電氨基酸,芳香族氨基酸已被證明與酶分子持續(xù)性相關。因此,利用丙氨酸篩選方法探究帶電氨基酸殘基在酶分子結合與持續(xù)性催化過程中的作用,結果表明,與芳香族氨基酸類似,活性架構中遠端帶電氨基酸的突變對酶分子催化影響較小:而催化位點附近的氨基酸殘基突變會造成酶分子活力的明顯變化。特別是將與+1位點具有相互作用的R264突變?yōu)楸彼岷?突變體對不溶性底物的降解酶活明顯升高,提高了 1.2倍,而對可溶性底物的酶活下降。除了R264A外,K186A的聚糖和寡糖降解酶活均有所提高(聚糖酶活增加了 55%),其突變在不影響酶分子整體持續(xù)性的基礎上增加了產物釋放能力。此外,結構的分析還確定了一個可能影響酶分子催化的關鍵位點D208,其突變會導致酶分子對聚糖及可溶性寡糖的催化能力喪失。總之,酶分子活性架構中帶電氨基酸的突變分析表明其在酶分子結合與持續(xù)性催化過程中的功能,這為酶分子下一步的設計提供了新的思路。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q93;TQ920.1
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 生物質資源概述
        1.1.1 生物質資源定義及組成
        1.1.2 生物質資源的特點
        1.1.3 生物質資源的綜合利用與生物質廢棄物的形成
    1.2 生物質廢棄物的組成及特點
        1.2.1 生物質廢棄物的分類
        1.2.2 植物細胞壁組成成分
        1.2.3 真菌細胞壁組成成分
        1.2.4 細菌細胞壁組成成分
    1.3 生物質廢棄物主要降解酶系組成及特點
        1.3.1 植物細胞壁的主要降解酶系
        1.3.2 真菌細胞壁的主要降解酶系
        1.3.3 細菌細胞壁的主要降解酶系
    1.4 參與生物質廢棄物轉化的微生物及其功能基因組
        1.4.1 放線菌與生物質轉化
        1.4.2 真菌與生物質轉化
    1.5 生物質廢棄物降解生境中微生物群落的動態(tài)變化與分析
    1.6 立題依據
第二章 生物質廢棄物高效降解生境中嗜熱放線菌的篩選與鑒定
    2.1 材料與方法
        2.1.1 樣品來源
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 實驗儀器與試劑
        2.1.4 生物質廢棄物降解生境樣品中嗜熱菌種的篩選與純化
        2.1.5 菌種分子鑒定
    2.2 實驗結果與分析
        2.2.1 生物質廢棄物降解生境樣品中嗜熱放線菌的篩選與純化
        2.2.2 嗜熱放線菌的形態(tài)學表征與鑒定
    2.3 小結與討論
第三章 整合組學分析Streptomyces sp.F-3的降解偏好性
    3.1 材料與方法
        3.1.1 菌株和培養(yǎng)基
        3.1.2 實驗儀器與試劑
        3.1.3 基因組測序
        3.1.4 搖瓶發(fā)酵
        3.1.5 生理生化測定
        3.1.6 酶活及酶譜測定
        3.1.7 粗酶液的LC-MS/MS檢測
    3.2 實驗結果與分析
        3.2.1 基因組預測分析胞內外代謝關鍵途徑與相關功能基因
        3.2.2 不同碳源下F-3菌株生理生化性質動態(tài)分析
        3.2.3 利用酶譜技術分析不同碳源條件對菌體胞外功能酶系分泌的影響
        3.2.4 利用LC-MS/MS精細分析不同碳源誘導條件下胞外功能酶系的分泌差異
    3.3 小結與討論
第四章 利用蛋白質組學方法分析Streptomyces sp.F-3對生物質廢棄物的高效降解機制
    4.1 材料與方法
        4.1.1 菌株和培養(yǎng)基
        4.1.2 實驗儀器與試劑
        4.1.3 搖瓶發(fā)酵
        4.1.4 LC-MS/MS質譜檢測及數據庫搜索
        4.1.5 數據分析
    4.2 實驗結果與分析
        4.2.1 菌渣誘導嗜熱鏈霉菌F-3功能酶系的表達差異分析
        4.2.2 嗜熱鏈霉菌F-3分泌的真菌細胞壁降解酶系
        4.2.3 嗜熱鏈霉菌F-3分泌的細菌細胞壁降解酶系
        4.2.4 系統分析F-3胞外蛋白的高效降解機制
        4.2.5 不同底物誘導嗜熱鏈霉菌F-3胞內蛋白酶及轉運蛋白表達差異分析
        4.2.6 聚類分析蛋白酶的作用機制
    4.3 小結與討論
第五章 Streptomyces sp.F-3的幾丁質高效降解協同機制分析
    5.1 材料與方法
        5.1.1 菌株和培養(yǎng)基
        5.1.2 底物制備
        5.1.3 LC-MS/MS分析胞外分泌蛋白
        5.1.4 基因克隆、表達和蛋白質純化
        5.1.5 幾丁質酶活性測定
        5.1.6 水解產物譜分析
        5.1.7 序列及結構生物信息學分析
    5.2 實驗結果與分析
        5.2.1 基因組及結構域組成分析
        5.2.2 利用蛋白質譜分析幾丁質酶的表達差異
        5.2.3 幾丁質酶系的表征與生理生化測定
        5.2.4 幾丁質酶對不同底物的降解特異性分析
        5.2.5 幾丁質酶對不同底物作用模式差異分析
        5.2.6 GH18亞家族幾丁質酶的結構生物信息學分析
        5.2.7 幾丁質酶的協同作用分析
    5.3 小結與討論
第六章 幾丁質酶SsChi18A持續(xù)性作用的分子機制研究
    6.1 材料與方法
        6.1.1 菌株與質粒
        6.1.2 儀器與試劑
        6.1.3 培養(yǎng)基制備
        6.1.4 引物設計
        6.1.5 突變質粒的構建與擴增
        6.1.6 異源表達突變體蛋白及蛋白純化
        6.1.7 生物信息學分析
        6.1.8 野生型和突變體蛋白的酶學性質測定
    6.2 實驗結果與分析
        6.2.1 GH18家族幾丁質酶活性架構中關鍵氨基酸組成分析
        6.2.2 持續(xù)性幾丁質酶SsChi18A極性氨基酸與底物相互作用分析
        6.2.3 幾丁質酶的異源表達和分離純化
        6.2.4 野生型及突變體酶的催化活性測定
        6.2.5 野生型及突變體酶的寡糖水解產物譜測定
        6.2.6 SsChi18A中關鍵氨基酸影響酶水解活性的分子機制
    6.3 小結與討論
全文總結與展望
參考文獻
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