進(jìn)入21世紀(jì),資源與環(huán)境成為影響人類可持續(xù)發(fā)展的突出問題。特別是生物工業(yè)技術(shù)產(chǎn)業(yè)形成高附加值產(chǎn)品的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量生物質(zhì)廢棄物,其化學(xué)成分復(fù)雜,有的存在大量抗生素等環(huán)境有害物質(zhì),因此如何高效、高值轉(zhuǎn)化生物質(zhì)廢棄物就成為當(dāng)前生物技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。微生物在生物質(zhì)廢棄物的降解過程中發(fā)揮了重要作用,全面系統(tǒng)地篩選、認(rèn)識(shí)并改造相關(guān)微生物已成為研究重點(diǎn)。本研究從天然生境中篩選獲得一系列高溫放線菌株。利用整合功能組學(xué)方法研究了嗜熱鏈霉菌F-3對(duì)生物質(zhì)廢棄物的降解偏好性,明確了其在菌渣等危險(xiǎn)生物質(zhì)廢棄物轉(zhuǎn)化過程中的重要作用。為了深入研究功能酶系的作用,克隆表達(dá)了該菌6個(gè)高溫、耐堿的幾丁質(zhì)酶組分,利用結(jié)構(gòu)信息組學(xué)技術(shù)揭示了相關(guān)酶系高效協(xié)同降解的分子機(jī)制;并對(duì)其中關(guān)鍵的持續(xù)性幾丁質(zhì)酶SsChi18A的活性架構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)功能分析,初步闡明其高效持續(xù)性作用的分子機(jī)制。相關(guān)研究為工業(yè)微生物發(fā)酵菌渣等生物質(zhì)廢棄物的高效高值轉(zhuǎn)化等奠定了理論基礎(chǔ)。本文取得如下研究成果:1.從生物質(zhì)廢棄物降解生境中篩選獲得一系列具有高效降解活性的嗜熱放線菌菌株。微生物在生物質(zhì)廢棄物的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了重要作用。玉米秸稈混合牛糞降解生境中含有豐富的微生物群落,利用宏基因組及宏蛋白質(zhì)組分析表明,高溫放線菌在其中占據(jù)重要地位。經(jīng)過對(duì)生境樣品的篩選和純化,共獲得8株生物質(zhì)廢棄物降解相關(guān)的嗜熱放線菌,分別來自諾卡氏菌屬、擬諾卡氏菌屬、鏈霉菌屬以及喜熱裂孢菌屬,相關(guān)菌株的獲得為后繼研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。2.利用整合功能組學(xué)方法分析了嗜熱鏈霉菌F-3對(duì)生物質(zhì)廢棄物的降解偏好性。嗜熱鏈霉菌F-3菌株篩選自天然高溫生物質(zhì)降解生境,其最適生長溫度為50℃。全基因組測(cè)序表明,其基因組中含有多種與有機(jī)廢棄物降解代謝相關(guān)的功能基因和與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因簇。其中編碼木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶類基因有18種,幾丁質(zhì)降解相關(guān)基因有9種,還有71種蛋白酶編碼基因等,這表明其在生物質(zhì)廢棄物的降解過程有較大潛力。利用多種不同碳源對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng),并對(duì)其胞外功能酶系的種類、濃度等動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行系統(tǒng)分析,結(jié)果表明胞外酶系中幾丁質(zhì)酶類及β-1,3-葡聚糖酶高效誘導(dǎo)表達(dá);木質(zhì)纖維素降解酶類分泌量低,同時(shí)胞外還檢測(cè)到了大量蛋白酶類表達(dá),特別是在發(fā)酵后期表達(dá)量明顯升高,因此鏈霉菌F-3應(yīng)在天然生境中的生態(tài)位應(yīng)該是真菌等殘余菌體的高效降解利用者。鏈霉菌F-3降解偏好性的闡明,有助于指導(dǎo)其工業(yè)應(yīng)用方向。3.以3種工業(yè)微生物發(fā)酵菌渣為底物,利用功能蛋白質(zhì)組學(xué)分析證明了嗜熱鏈霉菌F-3通過分泌多種類和多組分降解酶對(duì)生物質(zhì)廢棄物進(jìn)行降解轉(zhuǎn)化。以工業(yè)生產(chǎn)中微生物發(fā)酵剩余的黑曲霉菌渣、酵母菌菌渣及產(chǎn)大觀霉素的鏈霉菌菌渣等生物質(zhì)廢棄物為底物,分析了鏈霉菌F-3在菌渣降解過程中,功能酶系的變化規(guī)律。結(jié)果表明,鏈霉菌F-3可直接利用相關(guān)菌渣生長,未受廢棄物中殘余抗生素等物質(zhì)抑制。三種菌渣的發(fā)酵液中均檢測(cè)到4種幾丁質(zhì)水解酶、2種幾丁質(zhì)氧化酶以及3種β-1,3-葡聚糖酶組分;這些水解酶來自不同的家族,具有不同的結(jié)構(gòu)域組成。此外,在大觀霉素菌渣中檢測(cè)到3種β-N-乙酰己糖苷酶,這些酶組分應(yīng)參與真菌細(xì)胞壁多糖的高效降解轉(zhuǎn)化。蛋白質(zhì)組還檢測(cè)到14種胞外蛋白酶以及40種胞內(nèi)蛋白酶的表達(dá),其中S8家族的內(nèi)切絲氨酸蛋白酶在胞外表達(dá)量最高;且5種S8家族蛋白酶活性架構(gòu)具有不同分子表面性質(zhì),其精確識(shí)別與結(jié)合可高效協(xié)同降解蛋白質(zhì)形成肽片段;另外,胞外還存在大量金屬蛋白酶,可與內(nèi)切絲氨酸蛋白酶及外切氨肽酶協(xié)同降解肽段片段形成小肽及部分氨基酸。大量肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的確定證實(shí)了該鏈霉菌可吸收相關(guān)肽段,并通過胞內(nèi)氨肽酶及頭羧肽酶高效協(xié)同的方式快速降解轉(zhuǎn)化相關(guān)肽類。鏈霉菌F-3對(duì)工業(yè)生物質(zhì)廢棄物高效降解利用的潛能分析為其進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。4.從鏈霉菌F-3基因組中克隆表達(dá)了 6種高溫、耐堿的幾丁質(zhì)酶組分,并利用結(jié)構(gòu)信息學(xué)技術(shù)揭示了相關(guān)酶系高效協(xié)同降解的分子機(jī)制。幾丁質(zhì)是類似結(jié)晶纖維素的一類難降解生物質(zhì)。嗜熱鏈霉菌F-3具有耐高溫耐堿性的幾丁質(zhì)降解活性,對(duì)其中6種幾丁質(zhì)降解相關(guān)酶組分進(jìn)行了異源表達(dá),包括3種來自GH18家族幾丁質(zhì)酶(SsChi18A,SsChi18B和SsChil8C),1種GH19家族的幾丁質(zhì)酶(SsChi19A),1種GH20家族的β-N-乙酰己糖胺酶(SsGH20A)和1種來自AA10家族的裂解多糖單加氧酶(SsLPMO10A)。生化測(cè)定結(jié)果表明這些水解酶都可耐受70℃的高溫,并且在pH值為4至1 1時(shí)酶活相對(duì)穩(wěn)定。產(chǎn)物譜分析表明這些幾丁質(zhì)降解酶具有不同的降解模式,在幾丁質(zhì)降解過程中顯示明顯的協(xié)同效應(yīng)�；诮Y(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析,GH18幾丁質(zhì)酶組分不同作用模式可能是由其活性架構(gòu)中的Loop差異引起的。其中,SsChi18A是持續(xù)性幾丁質(zhì)酶,主要作用于不溶性幾丁質(zhì);而SsChi18B和SsChil8C是內(nèi)切非持續(xù)性酶類,對(duì)幾丁質(zhì)寡糖的降解顯示出更高活性。此外,蛋白質(zhì)組學(xué)及協(xié)同分析也表明氧化酶類SsLPMO10A的重要性,它可增強(qiáng)水解酶降解活性。總的來說,通過對(duì)菌株F-3分泌的多種幾丁質(zhì)降解酶的功能和生物信息學(xué)分析,闡明了其協(xié)同高效降解不溶性底物的物質(zhì)和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),將為天然幾丁質(zhì)的高效工業(yè)化轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備了功能基因素材。5.通過鏈霉菌F-3幾丁質(zhì)酶系中關(guān)鍵持續(xù)性幾丁質(zhì)酶SsChi18A的活性架構(gòu)分析,初步闡明其高效持續(xù)性作用的分子機(jī)制。酶分子的持續(xù)性是不溶性結(jié)晶底物高效降解的主要保證,因此持續(xù)性幾丁質(zhì)酶在結(jié)晶幾丁質(zhì)的高效降解過程發(fā)揮了重要作用。序列及結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析表明,持續(xù)性酶活性架構(gòu)中含有多個(gè)保守芳香族氨基酸與帶電氨基酸,芳香族氨基酸已被證明與酶分子持續(xù)性相關(guān)。因此,利用丙氨酸篩選方法探究帶電氨基酸殘基在酶分子結(jié)合與持續(xù)性催化過程中的作用,結(jié)果表明,與芳香族氨基酸類似,活性架構(gòu)中遠(yuǎn)端帶電氨基酸的突變對(duì)酶分子催化影響較小:而催化位點(diǎn)附近的氨基酸殘基突變會(huì)造成酶分子活力的明顯變化。特別是將與+1位點(diǎn)具有相互作用的R264突變?yōu)楸彼岷?突變體對(duì)不溶性底物的降解酶活明顯升高,提高了 1.2倍,而對(duì)可溶性底物的酶活下降。除了R264A外,K186A的聚糖和寡糖降解酶活均有所提高(聚糖酶活增加了 55%),其突變?cè)诓挥绊懨阜肿诱w持續(xù)性的基礎(chǔ)上增加了產(chǎn)物釋放能力。此外,結(jié)構(gòu)的分析還確定了一個(gè)可能影響酶分子催化的關(guān)鍵位點(diǎn)D208,其突變會(huì)導(dǎo)致酶分子對(duì)聚糖及可溶性寡糖的催化能力喪失�？傊�,酶分子活性架構(gòu)中帶電氨基酸的突變分析表明其在酶分子結(jié)合與持續(xù)性催化過程中的功能,這為酶分子下一步的設(shè)計(jì)提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q93;TQ920.1
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 生物質(zhì)資源概述
        1.1.1 生物質(zhì)資源定義及組成
        1.1.2 生物質(zhì)資源的特點(diǎn)
        1.1.3 生物質(zhì)資源的綜合利用與生物質(zhì)廢棄物的形成
    1.2 生物質(zhì)廢棄物的組成及特點(diǎn)
        1.2.1 生物質(zhì)廢棄物的分類
        1.2.2 植物細(xì)胞壁組成成分
        1.2.3 真菌細(xì)胞壁組成成分
        1.2.4 細(xì)菌細(xì)胞壁組成成分
    1.3 生物質(zhì)廢棄物主要降解酶系組成及特點(diǎn)
        1.3.1 植物細(xì)胞壁的主要降解酶系
        1.3.2 真菌細(xì)胞壁的主要降解酶系
        1.3.3 細(xì)菌細(xì)胞壁的主要降解酶系
    1.4 參與生物質(zhì)廢棄物轉(zhuǎn)化的微生物及其功能基因組
        1.4.1 放線菌與生物質(zhì)轉(zhuǎn)化
        1.4.2 真菌與生物質(zhì)轉(zhuǎn)化
    1.5 生物質(zhì)廢棄物降解生境中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化與分析
    1.6 立題依據(jù)
第二章 生物質(zhì)廢棄物高效降解生境中嗜熱放線菌的篩選與鑒定
    2.1 材料與方法
        2.1.1 樣品來源
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
        2.1.4 生物質(zhì)廢棄物降解生境樣品中嗜熱菌種的篩選與純化
        2.1.5 菌種分子鑒定
    2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.2.1 生物質(zhì)廢棄物降解生境樣品中嗜熱放線菌的篩選與純化
        2.2.2 嗜熱放線菌的形態(tài)學(xué)表征與鑒定
    2.3 小結(jié)與討論
第三章 整合組學(xué)分析Streptomyces sp.F-3的降解偏好性
    3.1 材料與方法
        3.1.1 菌株和培養(yǎng)基
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
        3.1.3 基因組測(cè)序
        3.1.4 搖瓶發(fā)酵
        3.1.5 生理生化測(cè)定
        3.1.6 酶活及酶譜測(cè)定
        3.1.7 粗酶液的LC-MS/MS檢測(cè)
    3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.2.1 基因組預(yù)測(cè)分析胞內(nèi)外代謝關(guān)鍵途徑與相關(guān)功能基因
        3.2.2 不同碳源下F-3菌株生理生化性質(zhì)動(dòng)態(tài)分析
        3.2.3 利用酶譜技術(shù)分析不同碳源條件對(duì)菌體胞外功能酶系分泌的影響
        3.2.4 利用LC-MS/MS精細(xì)分析不同碳源誘導(dǎo)條件下胞外功能酶系的分泌差異
    3.3 小結(jié)與討論
第四章 利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析Streptomyces sp.F-3對(duì)生物質(zhì)廢棄物的高效降解機(jī)制
    4.1 材料與方法
        4.1.1 菌株和培養(yǎng)基
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
        4.1.3 搖瓶發(fā)酵
        4.1.4 LC-MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)及數(shù)據(jù)庫搜索
        4.1.5 數(shù)據(jù)分析
    4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.2.1 菌渣誘導(dǎo)嗜熱鏈霉菌F-3功能酶系的表達(dá)差異分析
        4.2.2 嗜熱鏈霉菌F-3分泌的真菌細(xì)胞壁降解酶系
        4.2.3 嗜熱鏈霉菌F-3分泌的細(xì)菌細(xì)胞壁降解酶系
        4.2.4 系統(tǒng)分析F-3胞外蛋白的高效降解機(jī)制
        4.2.5 不同底物誘導(dǎo)嗜熱鏈霉菌F-3胞內(nèi)蛋白酶及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)差異分析
        4.2.6 聚類分析蛋白酶的作用機(jī)制
    4.3 小結(jié)與討論
第五章 Streptomyces sp.F-3的幾丁質(zhì)高效降解協(xié)同機(jī)制分析
    5.1 材料與方法
        5.1.1 菌株和培養(yǎng)基
        5.1.2 底物制備
        5.1.3 LC-MS/MS分析胞外分泌蛋白
        5.1.4 基因克隆、表達(dá)和蛋白質(zhì)純化
        5.1.5 幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定
        5.1.6 水解產(chǎn)物譜分析
        5.1.7 序列及結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析
    5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        5.2.1 基因組及結(jié)構(gòu)域組成分析
        5.2.2 利用蛋白質(zhì)譜分析幾丁質(zhì)酶的表達(dá)差異
        5.2.3 幾丁質(zhì)酶系的表征與生理生化測(cè)定
        5.2.4 幾丁質(zhì)酶對(duì)不同底物的降解特異性分析
        5.2.5 幾丁質(zhì)酶對(duì)不同底物作用模式差異分析
        5.2.6 GH18亞家族幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析
        5.2.7 幾丁質(zhì)酶的協(xié)同作用分析
    5.3 小結(jié)與討論
第六章 幾丁質(zhì)酶SsChi18A持續(xù)性作用的分子機(jī)制研究
    6.1 材料與方法
        6.1.1 菌株與質(zhì)粒
        6.1.2 儀器與試劑
        6.1.3 培養(yǎng)基制備
        6.1.4 引物設(shè)計(jì)
        6.1.5 突變質(zhì)粒的構(gòu)建與擴(kuò)增
        6.1.6 異源表達(dá)突變體蛋白及蛋白純化
        6.1.7 生物信息學(xué)分析
        6.1.8 野生型和突變體蛋白的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定
    6.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        6.2.1 GH18家族幾丁質(zhì)酶活性架構(gòu)中關(guān)鍵氨基酸組成分析
        6.2.2 持續(xù)性幾丁質(zhì)酶SsChi18A極性氨基酸與底物相互作用分析
        6.2.3 幾丁質(zhì)酶的異源表達(dá)和分離純化
        6.2.4 野生型及突變體酶的催化活性測(cè)定
        6.2.5 野生型及突變體酶的寡糖水解產(chǎn)物譜測(cè)定
        6.2.6 SsChi18A中關(guān)鍵氨基酸影響酶水解活性的分子機(jī)制
    6.3 小結(jié)與討論
全文總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表

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