石油污染是嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。微生物修復(fù)法已成為石油污染修復(fù)最可靠的方法之一,全面剖析降烴微生物的遺傳背景有助于設(shè)計出高效修復(fù)石油污染的方法。生物表面活性劑應(yīng)用廣泛,揭示微生物合成表面活性劑的遺傳基礎(chǔ)對實現(xiàn)異源表達(dá)和低成本制備至關(guān)重要。前人發(fā)現(xiàn)無色桿菌HZ01能降解石油烴和合成生物表面活性劑,并對其降解石油烴的轉(zhuǎn)錄組(轉(zhuǎn)錄組#1)進(jìn)行了初步分析,但目前對降烴途徑和某些關(guān)鍵功能基因未予明晰,其基因組序列仍未被測定。本文以菌株HZ01為研究對象,深入分析了其轉(zhuǎn)錄組#1,進(jìn)行了全基因組和轉(zhuǎn)錄組#2(關(guān)于生物表面活性劑合成的轉(zhuǎn)錄組)的測序分析,并對部分功能基因進(jìn)行了驗證。獲得的主要創(chuàng)新性成果如下:(1)在轉(zhuǎn)錄組#1中,對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、滲透壓調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)、DNA損傷修復(fù)和差異表達(dá)顯著的基因進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)石油處理16 h會導(dǎo)致菌株HZ01中多個基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變。YhbH(可降低翻譯效率)和CotE(與芽孢形成有關(guān))表達(dá)顯著上調(diào)以及某些重要結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因表達(dá)顯著下調(diào)表明石油處理16 h對菌株HZ01產(chǎn)生了局部毒性。(2)獲得了菌株HZ01的基因組草圖序列(5532918 bp),預(yù)測出5162個基因,鑒定出大量與次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因(包括基因簇terpene、phosphonate、siderophore、t1pks、arylpolyene、resorcinol和ectoine)。碳源利用實驗表明,該菌株不能以部分常見的碳水化合物為唯一碳源,原因是與碳水化合物轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因量較少以及缺少某些與糖代謝相關(guān)的重要酶基因。紙片擴(kuò)散法藥敏實驗顯示,該菌株對頭孢菌素類、氨基糖甙類、多肽類和碳青霉烯類抗生素耐藥,并從其基因組中鑒定出耐藥基因、毒力基因及與致病性相關(guān)的II、VI型分泌系統(tǒng)。(3)菌株HZ01以檸檬酸為唯一碳源時,其發(fā)酵液具有良好的乳化活性,表明發(fā)酵液中存在生物表面活性劑,其乳化作用可促進(jìn)該菌株降解石油烴。菌株HZ01大量與石油烴降解直接相關(guān)的蛋白,不AlkB羥化酶及其同源物;該菌株擁有正構(gòu)烷烴端氧化途徑的完整酶系,參與鄰苯二酚途徑的基因較齊全,缺少部分甲烷氧化的必需酶,不次端氧化途徑和環(huán)烷烴降解的Baeyer-Villiger單加氧酶,表明該菌株通過端氧化途徑降解正構(gòu)烷烴,主要利用鄰苯二酚途徑降解芳香族化合物,不能進(jìn)行甲烷氧化和環(huán)烷烴降解。石油處理16 h導(dǎo)致其三羧酸循環(huán)途徑被抑制,激活了端氧化途徑的以下步驟:正構(gòu)烷烴的起始氧化;脫氫酶、脂肪酸羥化酶和�；o酶A合成酶催化的反應(yīng);脂肪酸β-氧化。(4)在轉(zhuǎn)錄組#2中鑒定出5028個轉(zhuǎn)錄本;對差異表達(dá)顯著的基因、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、雙組分系統(tǒng)和三羧酸循環(huán)途徑進(jìn)行了分析。熒光定量PCR實驗表明,轉(zhuǎn)錄組#2的基因差異表達(dá)分析準(zhǔn)確,結(jié)果可靠。(5)以下蛋白的編碼基因至少在兩次測序分析中被鑒定出:Lux R家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、3-oxoacyl-ACP reductase、acyltransferase、OmpA、thioesterase、glycosyltransferase、3-oxoacyl-ACP合成酶,它們極有可能參與菌株HZ01的生物表面活性劑合成;完整的乙醛酸循環(huán)途徑可能與該菌株的糖脂類表面活性劑合成有關(guān);該細(xì)菌中與生物表面活性劑合成相關(guān)的基因不是以基因簇形式存在。
【學(xué)位單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：X172;Q78
【部分圖文】：

本文的技術(shù)路線Fig.1-1Technicalrouteofthisstudy(a)對菌株HZ01降解石油烴的轉(zhuǎn)錄組(轉(zhuǎn)錄組#1)進(jìn)行更深入的分析；(b)(c)#1

、“metabolic process”(圖3-1)。經(jīng)石油處理后，菌株HZ01中部分基因和代謝途處于活躍狀態(tài)，以執(zhí)行特定的生理響應(yīng)。圖3-1基因(unigenes)的GO功能分類Fig. 3-1 Gene ontology (GO) classification of unigenes獲得GO注釋的基因總數(shù)是3081，其中650個是差異表達(dá)基因

注釋結(jié)果(圖3-2)顯示，富集差異表達(dá)基因較多的依次是“amino acidtransport and metabolism”(122個差異表達(dá)基因)、“general function prediction only”(77個)、“transcription”(63個)、“energy production and conversion”(61個)、“translation, ribosomal structure and biogenesis”(55個)。圖3-2差異表達(dá)基因(DEGs)的COG功能分類Fig. 3-2 COG classification of differentially expressed genes (DEGs)共有637個差異表達(dá)基因在COG數(shù)據(jù)庫中獲得注釋；圖中每個柱子上的數(shù)字表示注釋為相應(yīng)COG分類的差異表達(dá)基因數(shù)目。3.2.2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)COG注 釋 結(jié) 果 顯 示 ， 共 有63個 差 異 表 達(dá) 基 因(DEGs)注 釋 為“Transcription”(圖3-2)；11個基因注釋為LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[100]，該類調(diào)控因子可調(diào)節(jié)細(xì)胞運動、群體感應(yīng)和芳香族化合物代謝相關(guān)基因的表達(dá)�；虿町惐磉_(dá)分析結(jié)果顯示，在石油處理組中有8個與細(xì)胞運動相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)(表3-1)，例如：Unigene323編碼鞭毛鉤相關(guān)蛋白FlgK；Unigene521編碼鞭毛蛋白；

本文編號：2869355