孔雀石綠(Malachite green),是一種三苯甲烷類染料,在食品.衛(wèi)生.紡織等工業(yè)中普遍使用,自上世紀(jì)三十年代以來(lái)也作為抗菌劑和殺蟲(chóng)劑廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),它具有致癌、致畸、致突變即“三致”作用,因此人們開(kāi)始關(guān)注由此引發(fā)的環(huán)境污染和食品安全問(wèn)題。在去除這種污染物的多種方法中微生物修復(fù)法具有成本低、不會(huì)造成二次污染的優(yōu)勢(shì),因此篩選高效降解孔雀石綠的微生物菌株,掌握其降解特性,探索降解的作用機(jī)理,具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究的目標(biāo)是分離、篩選能夠在低孔雀石綠濃度環(huán)境中降解孔雀石綠的菌株,并對(duì)該菌株的分類地位、生物學(xué)特性以及在各種環(huán)境條件下降解孔雀石綠的特性進(jìn)行研究,以期為孔雀石綠環(huán)境污染的修復(fù)工作提供科學(xué)依據(jù)；同時(shí)對(duì)其降解酶基因進(jìn)行克隆和表達(dá),為進(jìn)一步研究其基因功能、構(gòu)建具有更強(qiáng)降解能力的基因工程菌奠定基礎(chǔ)。采用選擇性培養(yǎng)基,從頻繁使用孔雀石綠水產(chǎn)育苗池的水樣中分離到26株孔雀石綠降解菌,其中MDB-1降解效率最高,經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,鑒定為Pseudomonas stutzeri MDB-1。對(duì)以上26株孔雀石綠降解菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,孔雀石綠降解菌主要產(chǎn)生于假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobater),產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、微球菌屬(Microococcus)和嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)六個(gè)大類。對(duì)菌株MDB-1的最適生長(zhǎng)條件的研究表明：菌株MDB-1的最適生長(zhǎng)溫度為30℃；最適初始pH在7左右；裝液量小于50mL/250mL時(shí),生長(zhǎng)旺盛；NaCl濃度0～3%范圍內(nèi)MDB-1均可生長(zhǎng),最適NaCl濃度為1%。在供試的幾種碳源中,MDB-1對(duì)淀粉和糊精的利用較好,麥芽糖和葡萄糖次之；在以葡萄糖為碳源同時(shí)以有機(jī)氮作氮源時(shí),以酵母提取物為最佳,MDB-1對(duì)無(wú)機(jī)氮源利用普遍較差。MDB-1在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng),0～6h為延滯期,6～12h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,12～0 h為穩(wěn)定期,20 h以后進(jìn)入衰亡期。對(duì)MDB-1降解特性的研究表明：MDB-1能夠以孔雀石綠作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng),在48 h內(nèi)可使10mg-L-1的孔雀石綠完全降解。它同時(shí)還能降解結(jié)晶紫、堿性品紅等三苯甲烷類染料。MDB-1降解孔雀石綠的濃度以50mg-L-1以下為宜,特別是低濃度(1-5mg·L-1)下能夠徹底降解孔雀石綠。MDB-1降解孔雀石綠的最適溫度為25℃-30℃,最適pH值為8.0～9.0；在250mL三角瓶中裝液量以25 mL降解效果最好,接種量以4.5×10！(3%)為宜。添加乳糖、糊精、淀粉、麥芽糖、蔗糖、果糖等碳源以及酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏和(NH4)2SO4等氮源均可提高M(jìn)DB-1對(duì)孔雀石綠的降解。連續(xù)添加孔雀石綠MDB-1可反復(fù)降解5次以上。根據(jù)已報(bào)道的三苯甲烷還原酶基因序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR方法從降解菌MDB-1中克隆到了三苯甲烷還原酶基因tmr2,其堿基對(duì)數(shù)為864 bp,編碼288個(gè)氨基酸。將MDB-1中tmr2基因序列與GeneBank中同源性較高的4個(gè)序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),在基因水平上,5株降解菌的三苯甲烷還原酶基因有9個(gè)位點(diǎn)堿基有差異；相互之間的同源性為99%-100%；在氨基酸水平上,5株降解菌的三苯甲烷還原酶有5個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基有差異,相互之間的同源性也為99%-100%,根據(jù)基因和氨基酸的差異可初步將5株菌分為A、B兩種亞型。采用SEFA-PCR的方法從MDB-1中分別克隆到tmr2基因上游1600bp和下游3000bp的堿基序列,通過(guò)比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)tmr2基因下游存在轉(zhuǎn)座酶,而且tmr2基因G+C含量與16S rDNA G+C%含量相差較大,由此初步推測(cè)lmr2很有可能在孔雀石綠降解菌之間存在漂移現(xiàn)象。將MDB-1中編碼三苯甲烷還原酶的tmr2基因連接到表達(dá)質(zhì)粒載體pET29a上在E coli BL21中實(shí)現(xiàn)了基因的超量表達(dá)。SDS-PAGE分析表明,tmr2編碼的蛋白單個(gè)亞基的分子量為30 kd。該蛋白為依賴于輔酶NADH (NADPH)的三苯甲烷還原酶(Tmr2),能夠快速降解孔雀石綠和結(jié)晶紫。在對(duì)表達(dá)后純化的Tmr2酶學(xué)性質(zhì)的研究中,確立了酶學(xué)反應(yīng)體系為：0.1 mol·L-1 PBS (pH7.5) 969μL, 5mg·mL-1 MG 6 μL 5mmol·L-1 NADH 20μL,酶5μL,反應(yīng)1 min,然后用1μL CH2Cl2中止反應(yīng),立即測(cè)定OD622。一個(gè)酶活力單位(U)定義為：在pH 7.5,溫度50℃條件下,每分鐘催化轉(zhuǎn)化1μmol·L-1孔雀石綠所需要的酶量。Tmr2最適反應(yīng)溫度為50℃,其熱穩(wěn)定性較好,在60℃以下保持30min,其酶活仍能保持65%以上；最適pH為7.5,在pH5.0～8.0范圍內(nèi)能保持較高的酶活；Ag+、Cu2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+等13種金屬離子中除Ca2+、 Zn2+、Mg2+、Li+隨濃度升高作用變化不大外,其它金屬離子都隨濃度升高而抑制作用增強(qiáng)。將MDB-1中編碼三苯甲烷還原酶的tmr2結(jié)構(gòu)基因連接到表達(dá)質(zhì)粒載體pPICZaA上,在巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris GS115中得到了表達(dá)。表達(dá)蛋白主要分泌在上清液中,使酶的制取更為方便。通過(guò)對(duì)酵母表達(dá)條件的優(yōu)化,獲得了搖瓶高密度發(fā)酵的最佳條件：以BMGY作為種子培養(yǎng)基,菌體密度OD600達(dá)到12時(shí),重懸于1/10體積的BMMY中開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá),此時(shí)菌體密度相當(dāng)于OD600達(dá)到120,甲醇誘導(dǎo)劑量為2.5%,pH值6.0,誘導(dǎo)72 h,表達(dá)蛋白的酶活達(dá)到最大。在此優(yōu)化條件下,上清液酶活可達(dá)到134.9U,比優(yōu)化前提高了3.6倍。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：X592;X172
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號(hào)與縮略語(yǔ)說(shuō)明
前言
文獻(xiàn)綜述 三苯甲烷類染料的生物降解研究進(jìn)展
    1 三苯甲烷類染料概述
        1.1 三苯甲烷類染料的用途、分類和主要化合物結(jié)構(gòu)
        1.2 三苯甲烷染料對(duì)水環(huán)境的污染
        1.3 孔雀石綠對(duì)水產(chǎn)品的污染和對(duì)人類的危害
            1.3.1 孔雀石綠的性質(zhì)
            1.3.2 孔雀石綠的應(yīng)用
            1.3.3 孔雀石綠對(duì)水生動(dòng)物的毒性
            1.3.4 孔雀石綠對(duì)人和哺乳動(dòng)物的毒性
        1.4 孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法
    2 水體中三苯甲烷類染料的去除研究
        2.1 化學(xué)和物理方法
        2.2 生物技術(shù)方法
            2.2.1 分離篩選高效降解微生物
            2.2.2 優(yōu)化外界環(huán)境因素
            2.2.3 共代謝降解
    3 三苯甲烷類染料生物降解的機(jī)理研究
        3.1 降解途徑
        3.2 微生物降解三苯甲烷類染料的酶學(xué)研究
        3.3 微生物降解三苯甲烷類染料的基因克隆和表達(dá)研究
    4 微生物降解三苯甲烷類染料研究的前景與展望
    參考文獻(xiàn)
實(shí)驗(yàn)部分
    第一章 孔雀石綠降解菌的分離鑒定及其生長(zhǎng)和降解特性研究
        1 材料與方法
            1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑
            1.2 降解菌株的富集、分離與純化
            1.3 降解菌株的16S rDNA序列分析
                1.3.1 降解菌株總DNA的提取
                1.3.2 降解菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增
                1.3.3 PCR產(chǎn)物的T/A克隆
                1.3.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化
                1.3.5 質(zhì)粒DNA的小量提取
                1.3.6 16S rDNA序列測(cè)定
            1.4 降解菌株系統(tǒng)發(fā)育地位的確定
            1.5 降解菌株的形態(tài)特征及生理生化鑒定
            1.6 菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定
            1.7 孔雀石綠含量的測(cè)定
            1.8 無(wú)色孔雀石綠含量的檢測(cè)
            1.9 MDB-1對(duì)其它染料的降解
        2 結(jié)果與分析
            2.1 孔雀石綠檢測(cè)方法的驗(yàn)證
            2.2 環(huán)境樣品中孔雀石綠降解菌株的分離篩選
                2.2.1 孔雀石綠降解菌株的初篩
                2.2.2 孔雀石綠降解菌株的復(fù)篩
            2.3 MDB-1的菌落和個(gè)體形態(tài)
            2.4 MDB-1的16S rDNA序列分析
                2.4.1 基因組DNA的提取
                2.4.2 MDB-1的系統(tǒng)發(fā)育地位的確定
            2.5 MDB-1的生理生化特性
                2.5.1 MDB-1與近緣種的比較
                2.5.2 MDB-1對(duì)95種碳源的利用
            2.6 環(huán)境條件對(duì)降解菌株MDB-1生長(zhǎng)的影響
                2.6.1 溫度對(duì)菌株MDB-1生長(zhǎng)的影響
                2.6.2 pH對(duì)菌株MDB-1生長(zhǎng)的影響
                2.6.3 裝液量對(duì)菌株MDB-1生長(zhǎng)的影響
                2.6.4 NaCl對(duì)菌株MDB-1生長(zhǎng)的影響
                2.6.5 不同碳源對(duì)菌株MDB-1生長(zhǎng)的影響
                2.6.6 不同氮源對(duì)菌株MDB-1生長(zhǎng)的影響
                2.6.7 MDB-1對(duì)抗生素的耐受性
            2.7 MDB-1在最適生長(zhǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線
            2.8 MDB-1對(duì)孔雀石綠的降解
            2.9 環(huán)境條件對(duì)MDB-1降解孔雀石綠的影響
                2.9.1 孔雀石綠起始濃度對(duì)MDB-1降解孔雀石綠的影響
                2.9.2 初始pH值對(duì)MDB-1降解孔雀石綠的影響
                2.9.3 溫度對(duì)MDB-1降解孔雀石綠的影響
                2.9.4 裝液量對(duì)MDB-1降解孔雀石綠的影響
                2.9.5 接種量對(duì)MDB-1降解孔雀石綠的影響
                2.9.6 不同碳源對(duì)MDB-1降解孔雀石綠的影響
                2.9.7 不同氮源對(duì)MDB-1降解孔雀石綠的影響
            2.10 MDB-1在低濃度孔雀石綠下的降解
            2.11 MDB-1在連續(xù)添加孔雀石綠情況下的降解情況
            2.12 MDB-1降解對(duì)其他染料的降解
        3 討論
        本章小結(jié)
        參考文獻(xiàn)
    第二章 孔雀石綠降解關(guān)鍵基因的克隆及其側(cè)翼序列分析
        1 材料與方法
            1.1 培養(yǎng)基與試劑
            1.2 菌株與質(zhì)粒
            1.3 菌體總DNA和質(zhì)粒DNA的提取
            1.4 三苯甲烷還原酶基因的引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增
            1.5 側(cè)翼序列SEFA-PCR引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增
            1.6 產(chǎn)物的酶連、轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性克隆的篩選
            1.7 序列測(cè)定、比較與分析
        2 結(jié)果與討論
            2.1 PCR法克隆三苯甲烷還原酶基因
            2.2 序列測(cè)定與比較分析
                2.2.1 基因水平上的比較
                2.2.2 氨基酸水平上的比較
            2.3 tmr2基因側(cè)翼序列的擴(kuò)增及分析
            2.4 對(duì)tmr2基因上下游序列的分析
        本章小結(jié)
        參考文獻(xiàn)
    第三章 tmr2基因在大腸桿菌中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)研究
        1 材料與方法
            1.1 培養(yǎng)基與試劑
            1.2 菌株與質(zhì)粒
            1.3 三苯甲烷還原酶基因tmr2的PCR擴(kuò)增
            1.4 三苯甲烷還原酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建
                1.4.1 PCR產(chǎn)物和pET29a載體雙酶切
                1.4.2 酶切產(chǎn)物的純化、酶連、轉(zhuǎn)化與篩選
            1.5 重組酶的表達(dá)和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析
                1.5.1 重組酶的表達(dá)和樣品處理
                1.5.2 聚丙烯酰胺凝膠的灌制
                1.5.3 電泳
                1.5.4 染色脫色
            1.6 重組蛋白酶液的制備和純化
            1.7 蛋白含量的測(cè)定
            1.8 重組蛋白酶活性的檢測(cè)
            1.9 三苯甲烷還原酶的酶活力測(cè)定
            1.10 三苯甲烷還原酶反應(yīng)時(shí)間與酶濃度的確定
            1.11 三苯甲烷還原酶對(duì)NADH及NADPH的依賴性試驗(yàn)
            1.12 反應(yīng)條件對(duì)三苯甲烷還原酶活性的影響
                1.12.1 溫度對(duì)三苯甲烷還原酶活性的影響及酶的熱穩(wěn)定性
                1.12.2 pH對(duì)三苯甲烷還原酶活性的影響及酶的酸堿穩(wěn)定性
                1.12.3 金屬離子對(duì)三苯甲烷還原酶活性的影響
        2 結(jié)果
            2.1 表達(dá)載體構(gòu)建
            2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析
            2.3 表達(dá)蛋白的三苯甲烷還原酶活性檢測(cè)和蛋白質(zhì)含量測(cè)定
            2.4 三苯甲烷還原酶的反應(yīng)進(jìn)程曲線與酶濃度曲線
            2.5 三苯甲烷還原酶對(duì)NADH及NADPH的依賴性試驗(yàn)
            2.6 反應(yīng)條件對(duì)酶活性的影響
                2.6.1 三苯甲烷還原酶反應(yīng)的最適溫度和酶的熱穩(wěn)定性
                2.6.2 三苯甲烷還原酶反應(yīng)的最適pH和酶的酸堿穩(wěn)定性
                2.6.3 金屬離子對(duì)三苯甲烷還原酶活性的影響
        3 討論
        本章小結(jié)
        參考文獻(xiàn)
    第四章 tmr2基因在畢赤酵母中的表達(dá)及條件優(yōu)化
        第一節(jié) tmr2基因在畢赤酵母中的表達(dá)
            1 材料與方法
                1.1 菌株與質(zhì)粒
                1.2 酶及生化試劑
                1.3 培養(yǎng)基及有關(guān)的溶液配制
                1.4 培養(yǎng)條件
                1.5 引物設(shè)計(jì)
                1.6 PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系
                1.7 克隆質(zhì)粒pMD18-T-AS的構(gòu)建
                1.8 重組表達(dá)載體的線性化
                1.9 畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
                1.10 酵母基因組DNA的提取
                1.11 重組酵母的PCR驗(yàn)證
                1.12 tmr2基因在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)
                1.13 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析
                1.14 表達(dá)蛋白酶譜檢測(cè)
                1.15 表達(dá)蛋白酶活性的檢測(cè)
            2 結(jié)果與討論
                2.1 表達(dá)載體構(gòu)建
                2.2 tmr2基因在畢赤酵母中表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析
                2.3 表達(dá)蛋白的酶譜分析
                2.4 表達(dá)蛋白的活性檢測(cè)
        第二節(jié) 酵母表達(dá)條件的優(yōu)化
            1 材料和方法
                1.1 菌種
                1.2 培養(yǎng)基
                1.3 酵母工程菌表型的鑒定
                1.4 搖瓶中表達(dá)重組蛋白
                1.5 培養(yǎng)上清液中表達(dá)產(chǎn)物的酶活測(cè)定
                1.6 上清液中表達(dá)產(chǎn)物的蛋白含量測(cè)定
            2 結(jié)果
                2.1 酵母工程菌Mut+/Muts表型鑒定
                2.2 培養(yǎng)基的篩選
                2.3 不同誘導(dǎo)時(shí)間下酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和上清液酶活
                2.4 pH值的影響
                2.5 菌體密度的影響
                2.6 甲醇誘導(dǎo)濃度的影響
                2.7 優(yōu)化后菌體的生長(zhǎng)和上清液酶活
            3 討論
        本章小結(jié)
        參考文獻(xiàn)
全文總結(jié)
附錄1 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基及分子生物學(xué)試劑
    一、培養(yǎng)基
    二、試劑
附錄2 研究中獲得的相關(guān)DNA序列
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄
致謝

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7 趙敏敏;水溶液和微乳液中孔雀石綠與表面活性劑的相互作用研究[D];蘭州交通大學(xué);2015年

8 陳曉妮;二氧化氯和孔雀石綠對(duì)鯽魚(yú)的毒性作用研究[D];南昌大學(xué);2008年

9 嚴(yán)福祥;烏龜孔雀石綠浸泡后的組織病理學(xué)研究及肝臟全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定[D];暨南大學(xué);2010年

10 龔朋飛;孔雀石綠單克隆抗體的制備及其檢測(cè)試劑盒的初步研制[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

本文編號(hào)：2863161