汞是一種對(duì)人體有毒害作用的重金屬,土壤中的汞能夠通過(guò)作物吸收并沿食物鏈傳遞至人體,在人體中具有累積效應(yīng),攝入過(guò)多的汞會(huì)損害消化、神經(jīng)、泌尿及循環(huán)系統(tǒng)。汞已成為土壤環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)的必測(cè)項(xiàng)目之一,其定量檢測(cè)對(duì)于正確評(píng)價(jià)土壤汞的庫(kù)存量、及時(shí)開展土壤汞的污染修復(fù)具有十分重要的意義。熒光分光光度法檢測(cè)汞具有靈敏度高、檢出限低、選擇性好、簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn),已應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等諸多領(lǐng)域,為快速而準(zhǔn)確地定量檢測(cè)樣品中的汞提供了一種非常有效的方法。但是,如何進(jìn)一步拓展已有的熒光分析法在汞定量檢測(cè)中的應(yīng)用范圍,建立靈敏度更高、選擇性更好的土壤汞檢測(cè)方法,仍然是當(dāng)前需要解決的一項(xiàng)重要任務(wù)�；诖�,本文開展了以下四方面的研究。1、利用無(wú)標(biāo)記的分子信標(biāo)(MB)、單鏈核酸(ss DNA)及核酸染料Hoechst 33258建立了一種土壤中汞的定量檢測(cè)方法。在該方法中,分子信標(biāo)的莖完全設(shè)計(jì)成C-G堿基對(duì),環(huán)設(shè)計(jì)為與ss DNA互補(bǔ)但有多個(gè)胸腺嘧啶(T堿基)錯(cuò)配的序列。沒(méi)有Hg2+時(shí),Hoechst 33258與分子信標(biāo)作用較弱,其熒光信號(hào)很弱;有Hg2+時(shí),分子信標(biāo)的環(huán)與富含T堿基的ss DNA通過(guò)“T-Hg2+-T”特異性結(jié)合形成雙螺旋結(jié)構(gòu)(雙鏈DNA),Hoechst 33258與雙鏈DNA作用后熒光信號(hào)顯著增強(qiáng),可實(shí)現(xiàn)Hg2+的高靈敏檢測(cè)。在優(yōu)化條件下,Hg2+濃度在4×10-9-400×10-9 mol·L-1范圍內(nèi),Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度(?I)與Hg2+濃度(C)之間具有良好的線性關(guān)系,方法檢出限(3σ)為3×10-9 mol·L-1。應(yīng)用于污染土壤中汞的檢測(cè),其平均回收率在98.3%-103.3%。該方法所用的分子信標(biāo)不需要標(biāo)記,檢測(cè)成本低,檢測(cè)速度快,但相對(duì)而言,靈敏度較低。2、利用分子信標(biāo)、單鏈核酸(ss DNA)及高靈敏的核酸染料SYBR GreenⅠ,通過(guò)同步熒光分析法,建立了一種高靈敏度的土壤汞(Hg2+)定量檢測(cè)方法。分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)設(shè)計(jì)為熒光胺(6-carboxyfluorescein group,FAM),環(huán)設(shè)計(jì)為與ss DNA互補(bǔ)且T堿基錯(cuò)配的序列。在Hg2+存在時(shí),分子信標(biāo)的環(huán)與富含T堿基的ss DNA通過(guò)“T-Hg2+-T”特異性結(jié)合形成雙螺旋結(jié)構(gòu)(雙鏈DNA),分子信標(biāo)的莖被打開,熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分開,熒光恢復(fù);同時(shí),核酸染料SYBR GreenⅠ與雙鏈DNA作用,熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。SYBR GreenⅠ與FAM的最大激發(fā)波長(zhǎng)與最大發(fā)射波長(zhǎng)接近,當(dāng)Hg2+通過(guò)同步熒光分析法檢測(cè)時(shí),兩種熒光染料的熒光峰重疊,熒光信號(hào)增強(qiáng),可實(shí)現(xiàn)Hg2+的高靈敏檢測(cè)。在優(yōu)化條件下,Hg2+濃度在5×10-10-400×10-10 mol·L-1時(shí),SYBR GreenⅠ及FAM總的熒光強(qiáng)度(?I)與Hg2+濃度(C)間有良好的線性關(guān)系,方法檢測(cè)限(3σ)為3×10-10 mol·L-1。該法基于核酸染料SYBR GreenⅠ靈敏度高的特點(diǎn),結(jié)合FAM標(biāo)記單鏈核酸,利用SYBR GreenⅠ及FAM總的熒光強(qiáng)度對(duì)土壤中的汞進(jìn)行檢測(cè),可顯著地提高檢測(cè)靈敏度,降低其檢出限。3、單色熒光定量檢測(cè)汞時(shí),若樣品中存在能與探針?lè)磻?yīng)的核酸,容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。為此,利用兩條部分互補(bǔ)、富含T堿基染料標(biāo)記的單鏈核酸,結(jié)合氧化石墨烯(GO),采用同步熒光分析法,建立了一種土壤中汞的雙色定量檢測(cè)方法。這兩條單鏈核酸的3′端分別用6-carboxyfluorescein group(FAM)和6-carboxyx-rhodamine(ROX)兩種染料標(biāo)記。沒(méi)有Hg2+存在時(shí),染料標(biāo)記的單鏈核酸被吸附在GO的表面,熒光被猝滅,信號(hào)很弱;有Hg2+存在時(shí),兩條染料標(biāo)記的單鏈核酸與Hg2+通過(guò)“T-Hg2+-T”結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合,形成雙鏈核酸。由于雙鏈核酸不能被GO吸附,熒光不被猝滅,信號(hào)較強(qiáng)。在該體系中,FAM與ROX的最大激發(fā)波長(zhǎng)與最大發(fā)射波長(zhǎng)間的間隔很近,在通過(guò)同步熒光進(jìn)行分析時(shí),兩種染料的熒光信號(hào)可同時(shí)獲得,即可利用雙色熒光法對(duì)汞進(jìn)行定量檢測(cè)。在優(yōu)化條件下,Hg2+濃度在8×10-10-8×10-8 mol·L-1的范圍內(nèi),FAM與ROX總的熒光強(qiáng)度與Hg2+的濃度之間具有良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為5×10-10 mol·L-1。這種方法可識(shí)別樣品中能與探針?lè)磻?yīng)的核酸所產(chǎn)生的假陽(yáng)性信號(hào),進(jìn)一步提高了土壤樣品中汞分析的選擇性。4、在雙色熒光分析法檢測(cè)土壤汞的基礎(chǔ)上,利用兩條部分互補(bǔ)的富含T堿基的單鏈核酸(其中一條用染料ROX標(biāo)記),結(jié)合氧化石墨烯及核酸染料SYBR GreenⅠ,采用同步熒光分析法,建立一種靈敏度更高,檢測(cè)限更低的Hg2+雙色熒光定量檢測(cè)方法。沒(méi)有Hg2+時(shí),兩條單鏈核酸中有多個(gè)T-T錯(cuò)配堿基,不能形成雙螺旋結(jié)構(gòu),核酸染料SYBR GreenⅠ與核酸的作用很弱,熒光信號(hào)不強(qiáng);加入氧化石墨烯時(shí),兩種單鏈DNA均被氧化石墨烯吸附,熒光染料ROX的熒光被猝滅,熒光信號(hào)也很弱。有Hg2+時(shí),兩條單鏈核酸通過(guò)“T-Hg2+-T”特異性結(jié)合形成雙螺旋結(jié)構(gòu),與SYBR GreenⅠ的作用增強(qiáng),SYBR GreenⅠ的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng);加入氧化石墨烯時(shí),雙鏈核酸不能被氧化石墨烯吸附,ROX的熒光不能被猝滅,因此其熒光信號(hào)也會(huì)顯著增強(qiáng)。在優(yōu)化條件下,Hg2+濃度在5×10-10-500×10-10 mol·L-1之間時(shí),SYBR GreenⅠ及Carboxy-X-rhodamine(ROX)總的熒光強(qiáng)度(?IT)與Hg2+濃度(C)之間具有良好的線性關(guān)系,方法檢測(cè)限(3σ)為2×10-10 mol·L-1。該方法利用核酸染料SYBR GreenⅠ靈敏度高的特點(diǎn),結(jié)合ROX標(biāo)記單鏈核酸,既可利用雙色信號(hào)識(shí)別樣品中的假陽(yáng)性信號(hào),又可顯著提高檢測(cè)方法的靈敏度,降低方法的檢測(cè)限。上述四種方法均成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)土壤實(shí)際樣品的檢測(cè)。第一種檢測(cè)方法主要優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)成本低,適用于汞含量較高的土壤樣品的分析。第二種定量檢測(cè)方法最主要的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,檢出限低,適合土壤痕量汞的分析。第三種定量檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于能夠識(shí)別樣品中能與探針?lè)磻?yīng)的核酸所產(chǎn)生的假陽(yáng)性信號(hào),顯著提高檢測(cè)的選擇性,適合檢測(cè)汞含量中等的土壤樣品。第四種定量檢測(cè)方法既能識(shí)別樣品中能與探針?lè)磻?yīng)的核酸所產(chǎn)生的假陽(yáng)性信號(hào),又能顯著提高檢測(cè)靈敏度,降低檢出限,適于低濃度汞污染土壤的檢測(cè)。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：X833
【部分圖文】：

檢測(cè)原理圖

2-2b）；當(dāng)溶液中同時(shí)存在分子信標(biāo)、單鏈核酸及 Hg2＋時(shí)，Hoechs度顯著增強(qiáng)，目標(biāo) Hg2＋濃度不同，其熒光強(qiáng)度存在明顯的差別，且移至 460 nm 處（圖 2-2c,d）。由此說(shuō)明利用上述原理檢測(cè) Hg2＋是可

沖溶液對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果（圖 2-3）表明，在 pH 7.0-9.0 的范Hoechst 33258 的熒光強(qiáng)度隨 pH 的增加而增強(qiáng)，在 pH 8.2 時(shí)達(dá)到 增加而減弱。這主要有兩個(gè)原因，一是雙鏈的形成在 pH 略偏堿是熒光染料Hoechst 33258在堿性條件下熒光信號(hào)較強(qiáng) (Xiang et a 2011)。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道較接近，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇緩沖溶液
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2850776