四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素,其價(jià)格低廉,抗菌譜廣,是目前世界上使用最廣泛、用量最大的抗生素種類之一。由于其用量大,吸收少,大部分以原藥形式排出,容易在環(huán)境中積累。環(huán)境中殘留的四環(huán)素類抗生素嚴(yán)重影響土壤生態(tài)環(huán)境和植物生長,對人類健康構(gòu)成潛在危害�？焖儆行У那宄h(huán)境中的抗生素殘留已成為目前研究的熱點(diǎn)。雖然先前的研究中有許多四環(huán)素非生物降解的報(bào)道,但環(huán)境中微生物降解四環(huán)素及降解過程卻鮮為人知。此外,對于微生物在不同營養(yǎng)條件下抵抗并轉(zhuǎn)化四環(huán)素的分子機(jī)制尚不清晰。因此,篩選四環(huán)素降解特種微生物并弄清其降解機(jī)理,可為實(shí)際應(yīng)用提供四環(huán)素污染的土壤和水體的生物修復(fù)及環(huán)境治理技術(shù)的研發(fā)提供理論依據(jù),也為更多的抗生素的降解機(jī)理研究提供方法借鑒,具有較大的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究以四環(huán)素污染土壤為研究對象,分離篩選出四環(huán)素高效降解微生物;通過對微生物降解四環(huán)素特性的研究,建立微生物降解四環(huán)素的動力學(xué)模型;利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀捕捉四環(huán)素的微生物降解產(chǎn)物并推測降解途徑;分析降解菌株的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)特性提出微生物抵抗并降解四環(huán)素的分子機(jī)制。論文主要研究結(jié)果如下:從長期污染四環(huán)素的土壤中分離篩選出一株四環(huán)素高效降解菌DT1,該菌株不能以四環(huán)素作為唯一碳源,但可以在外源營養(yǎng)存在的條件下降解四環(huán)素。通過形態(tài)、生理生化特性和16S rRNA同源性分析,鑒定菌株DT1為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。通過研究DT1的生長條件表明:DT1為中溫菌,最適生長溫度為30oC,偏愛中性偏堿的環(huán)境(pH為7-10),而在酸性環(huán)境中生長顯著抑制,較少的裝液量(25-50 mL/250 m L)能為細(xì)菌生長提供更充足的氧氣,促進(jìn)其生長繁殖。通過研究接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度、初始pH等因素對DT1降解四環(huán)素的影響,探討微生物降解四環(huán)素的特性,結(jié)果表明:接種量對四環(huán)素的降解沒有顯著影響,當(dāng)初始pH為9,溫度為30oC,裝液量為50 mL/250 m L時(shí),四環(huán)素的降解率達(dá)到最大95%。通過對四環(huán)素降解過程的動力學(xué)擬合及推導(dǎo),得到DT1降解四環(huán)素的動力學(xué)模型。通過對不同初始四環(huán)素濃度與初始生物降解速率的擬合,發(fā)現(xiàn)Michaelis-Menten模型能夠很好的描述,經(jīng)計(jì)算v_(max)和K_m值分別為62.14 mg L~(-1)d~(-1)和80.52 mg L~(-1)。利用抑菌圈法研究了四環(huán)素微生物降解產(chǎn)物的抑菌效果,結(jié)果表明四環(huán)素生物降解和水解產(chǎn)物對大腸桿菌的抑制都減弱。采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對四環(huán)素的水解及生物降解產(chǎn)物進(jìn)行了分析鑒定,共捕捉到2種水解產(chǎn)物ETC及ISO-TC,6種四環(huán)素微生物降解產(chǎn)物,分別為TP 431、TP 415、TP 387、TP 370、ISO-TP 415、ISO-TP 387。通過降解產(chǎn)物的分析,提出了四環(huán)素經(jīng)微生物脫甲基、脫氫、脫羰基和脫氨基作用的酶催化代謝途徑。采用Illumina HiSeq X Ten高通量測序平臺,繪制了四環(huán)素降解菌株DT1的全基因組草圖。全基因組總長度為4.66 Mbp,平均長度為1124.14 bp,由41個scaffold組裝成。含有4146個基因,tRNA 71個,rRNA 10個,其它非編碼RNA 43個,GC含量為66.48%,預(yù)測的開放式閱讀框(ORFs)數(shù)為4052個,編碼蛋白為2787個,假蛋白為1153個。通過對基因組的生物信息學(xué)分析表明,該菌株有多種功能基因參與抗生素和異源物質(zhì)代謝及抗性。57個與抗生素抗性相關(guān)的基因,包括40種多重外排泵和β內(nèi)酰胺酶;12種重金屬陽離子外排泵及若干金屬離子抗性蛋白、金屬氧化酶和一些調(diào)節(jié)蛋白等共同造就其重金屬抗性;21種加氧酶基因(單加氧酶、雙加氧酶和其它加氧酶)可能參與異型物質(zhì)的代謝。8種不同的過氧化物酶參與細(xì)胞的解毒。將DT1基因組同其它三種無四環(huán)素降解能力的同種菌株進(jìn)行基因組比較,發(fā)現(xiàn)大部分基因組序列是保守的,但也有小部分區(qū)域?yàn)镈T1所特有,這部分基因可能與DT1的獨(dú)有特性相關(guān)。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并結(jié)合基因組和降解途徑結(jié)論,提出了四環(huán)素微生物降解的分子機(jī)理。7種蛋白質(zhì)參與了微生物細(xì)胞的自我修復(fù)解毒過程,6種酶可能直接的參與了微生物對四環(huán)素的降解:結(jié)瘤蛋白將四環(huán)素泵出細(xì)胞;HXGPT酶促進(jìn)核糖體保護(hù)蛋白活性;核糖體保護(hù)蛋白延長因子Tu和G阻止四環(huán)素連接于核糖體的30s亞基上;超氧化物歧化酶和過氧化物酶的聯(lián)合催化,將四環(huán)素4號位的氮甲基進(jìn)行脫離。通過比較不同營養(yǎng)條件下微生物降解速率關(guān)系和蛋白質(zhì)表達(dá)倍數(shù)差異,揭示了外源營養(yǎng)影響微生物對四環(huán)素降解的機(jī)理。結(jié)果表明,不同營養(yǎng)條件下超氧化物歧化酶上調(diào)表達(dá)的趨勢同四環(huán)素微生物降解趨勢相吻合,提出超氧化物歧化酶為控制四環(huán)素降解的限速酶。在饑餓條件下,降解菌與四環(huán)素抗性和降解相關(guān)的蛋白表達(dá)均在減弱,細(xì)胞僅通過消耗內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)糖原來維持細(xì)胞的生存,并保持細(xì)胞外膜的完整以抵抗外界的壓力,因此不能進(jìn)行四環(huán)素的降解。本研究系統(tǒng)的研究了四環(huán)素降解菌株降解四環(huán)素的動力學(xué)特性,構(gòu)建了微生物降解四環(huán)素的動力學(xué)模型;提出了四環(huán)素經(jīng)微生物脫甲基、脫氫、脫羰基和脫氨基作用的酶催化代謝途徑�；诂F(xiàn)有的報(bào)道,結(jié)合本研究的結(jié)論,提出了微生物降解四環(huán)素的分子機(jī)理,豐富了微生物降解四環(huán)素的分子機(jī)制。
【學(xué)位單位】：中國地質(zhì)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：X53;X172
【部分圖文】：

第一章 緒論1.1 四環(huán)類抗生素概況.1.1 四環(huán)素類抗生素的性質(zhì)與特點(diǎn)四環(huán)素類抗生素是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素[1-3]，包括四環(huán)素、金霉素、霉素等。它通過同細(xì)菌核糖體 30s 亞基上的酰胺-tRNA 結(jié)合位點(diǎn) A 結(jié)合，抑制菌蛋白質(zhì)的合成[4]，從而抑制細(xì)菌的生長繁殖。四環(huán)素類抗生素的基本結(jié)構(gòu)由氫四并苯環(huán)母核及 A 至 D 環(huán)上不同的功能基團(tuán)組成。其中 A-B 環(huán)間的 C4a、C12a的立體結(jié)構(gòu)，C4 位的氮二甲基，C3 位酚羥基，C2 位的酰胺基，，C11、C12、12a、C1 的烯酮結(jié)構(gòu)都決定了四環(huán)素類抗生素抗菌活性的基本藥效。四環(huán)素分子構(gòu)與活性的關(guān)系見圖 1.1[5]。這些基團(tuán)決定了四環(huán)素類抗生素的紫外特征光譜，且能與許多金屬陽離子發(fā)生螯合反應(yīng)形成不同顏色的金屬四環(huán)素螯合物[6]。

圖 1.2 本研究技術(shù)路線圖1.3.4 創(chuàng)新點(diǎn)本研究的主要創(chuàng)新點(diǎn)主要包含以下兩個方面：（1）篩選出對四環(huán)素高效降解的菌株 Stenotrophomonas maltophilia DT1，并系統(tǒng)的研究了 DT1 降解四環(huán)素的降解特性。（2）揭示了 DT1 中過氧化物還原酶對四環(huán)素脫氮甲基的機(jī)理，提出了 DT1 降解四環(huán)素的途徑。

圖 2.1 四環(huán)素降解菌 DT1 平板及顯微照片。四環(huán)素降解菌株的生理生化特征T1 的主要生理生化特征見表 2.1。從表中我們可以看出 DT1 接觸酶、氧MR 陽性，可以還原硝酸鹽、水解明膠、能在 0-5% NaCl 中生長，VP產(chǎn)生、淀粉水解呈陰性。表 2.1 四環(huán)素降解菌株 DT1 的生理生化特征項(xiàng)目 結(jié)果 項(xiàng)目 結(jié)果接觸酶 + 脲酶 +氧化酶 + 明膠 +淀粉水解 - NaCl 2% +H2S - NaCl 5% +硝酸鹽還原 + NaCl 7% -
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本文編號：2838495