發(fā)布時間：2020-10-10 02:35

　　 甲烷氧化菌能在溫和條件下特異的利用甲烷,具有應(yīng)用于甲烷減排和煤礦瓦斯治理的潛力。本論文在對我國典型煤礦土壤的甲烷氧化菌進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)分析的基礎(chǔ)上,確定甲烷氧化混合菌的富集培養(yǎng)策略,獲得高效利用甲烷的穩(wěn)定混合菌群,對其特性和功能進(jìn)行研究,實(shí)現(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng),并在實(shí)驗(yàn)室和煤礦現(xiàn)場進(jìn)行了瓦斯治理實(shí)驗(yàn)。 用多種分子生態(tài)學(xué)方法解析了瓦斯煤礦土壤中的甲烷氧化菌及相關(guān)微生物的組成信息。該樣品含有大量的甲烷氧化菌及甲基氧化菌,其中甲烷氧化菌以Ⅰ型為主,Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅹ型甲烷氧化菌的含量分別為78.6%、7.1%和14.3%。 分別以甲烷氣和人工瓦斯氣作為唯一碳源對土壤樣品進(jìn)行好氧選擇性傳代培養(yǎng)。富集過程中甲烷和乙烷的消耗能力得到顯著強(qiáng)化,總細(xì)菌的多樣性逐漸減少,Ⅰ型甲烷氧化菌則得到富集,20代以后菌群結(jié)構(gòu)和甲烷去除能力趨于穩(wěn)定。 研究了兩種氣體條件富集的混合菌群的特性,包括菌體形態(tài)、生長特性、代謝特性和微生物群落結(jié)構(gòu)。馴化后Ⅱ型甲烷氧化菌數(shù)量增加,人工瓦斯氣富集的混合菌菌群更豐富。混合菌比純菌的甲烷消耗能力更強(qiáng),且無代謝產(chǎn)物積累。菌群間的協(xié)同作用能有效避免產(chǎn)物抑制,有利于菌群結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。 對兩種條件得到的混合菌的功能進(jìn)行了系統(tǒng)分析。其在甲烷濃度為3~50%時都有較好的去除效果,最高可達(dá)241 ml CH4 h~(-1) OD660~(-1) (L culture)~(-1)。在20~42oC都能有效的去除甲烷。對H_2S、CO和SO_2等毒性氣體有很強(qiáng)的耐受性。混合菌保藏可用4oC充甲烷密封保存法、-80oC凍存菌體法和-80oC添加石蠟油凍存法。 以甲烷氣富集的混合菌為對象,研究了甲烷氧化混合菌的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)。成功開展了5L-300L和5L-600L的放大發(fā)酵實(shí)驗(yàn)�；旌暇诜糯笈囵B(yǎng)時,生長速度穩(wěn)定,且隨著發(fā)酵逐級放大,消耗甲烷能力以及菌群結(jié)構(gòu)都能夠保持穩(wěn)定。 在實(shí)驗(yàn)室模擬煤層、生物過濾實(shí)驗(yàn)中研究混合菌去除甲烷的能力,并在河南三個礦井進(jìn)行現(xiàn)場中試,將制備的菌液注入煤層并達(dá)飽和,甲烷去除效果顯著,說明富集的甲烷氧化混合菌有在煤礦中治理瓦斯的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：X172
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 課題背景
    1.2 甲烷氧化菌及甲烷單加氧酶
        1.2.1 甲烷氧化菌的分類及特性
        1.2.2 甲烷單加氧酶的基因與蛋白
        1.2.3 甲烷單加氧酶的催化特性
    1.3 甲烷氧化菌的應(yīng)用研究熱點(diǎn)
        1.3.1 甲烷氧化菌的培養(yǎng)工藝研究
        1.3.2 甲烷氧化菌的工業(yè)生物催化研究
        1.3.3 甲烷氧化菌的生物修復(fù)研究
        1.3.4 甲烷氧化菌及甲烷單加氧酶的基因工程研究
        1.3.5 甲烷氧化菌的分子生態(tài)學(xué)研究
    1.4 甲烷氧化菌在工業(yè)應(yīng)用中存在的問題
    1.5 應(yīng)用甲烷氧化菌治理煤礦瓦斯
        1.5.1 甲烷氧化菌在溫室氣體減排中的應(yīng)用
        1.5.2 煤礦瓦斯治理現(xiàn)狀及生物治理的可行性
    1.6 論文的主要研究內(nèi)容
        1.6.1 研究內(nèi)容
        1.6.2 研究框架
第2章 從煤礦土壤富集培養(yǎng)甲烷氧化混合菌
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.2.1 DNA 提取和純化
        2.2.2 PCR 擴(kuò)增16S rRNA 和功能基因
        2.2.3 核酸限制性片段長度多態(tài)性分析
        2.2.4 變性梯度凝膠電泳
        2.2.5 DNA 序列分析
        2.2.6 培養(yǎng)基及富集條件
        2.2.7 甲烷、乙烷的檢測方法
    2.3 煤礦土壤的特性分析
    2.4 煤礦土壤中甲烷氧化菌群落的功能基因解析
        2.4.1 基于功能基因pmoA 的 RFLP 分析
        2.4.2 基于功能基因mmoX 的RFLP 分析
        2.4.3 基于功能基因mxaF 的RFLP 分析
    2.5 不同條件從煤礦土壤富集甲烷氧化混合菌
        2.5.1 對甲烷和乙烷的消耗能力的變化
        2.5.2 富集過程的細(xì)菌群落變化
        2.5.3 富集過程的I型甲烷氧化菌群落變化
        2.5.4 富集過程的II型甲烷氧化菌群落變化
    2.6 本章小結(jié)
第3章 甲烷氧化混合菌的特性分析
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        3.2.1 菌種及培養(yǎng)方法
        3.2.2 顯微鏡和掃描電鏡觀察
        3.2.3 MMO 酶活測定
        3.2.4 代謝分析
    3.3 甲烷氧化混合菌的微生物群落分析
        3.3.1 基于16S rRNA 的RFLP 分析
        3.3.2 基于功能基因pmoA 的 RFLP 分析
        3.3.3 基于功能基因mmoX 的RFLP 分析
        3.3.4 基于功能基因mxaF 的RFLP 分析
    3.4 甲烷氧化混合菌的生長特性研究
        3.4.1 菌體形態(tài)
        3.4.2 生長狀況與干重曲線
        3.4.3 甲烷消耗與MMO 酶活
    3.5 甲烷氧化混合菌的代謝分析
    3.6 甲烷氧化混合菌的協(xié)同作用機(jī)理
    3.7 本章小結(jié)
第4章 甲烷氧化混合菌的功能分析和保藏
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        4.2.1 評價方法
        4.2.2 保藏方法
    4.3 對不同濃度甲烷的消耗能力
    4.4 不同溫度下對甲烷的消耗能力
    4.5 對毒性氣體的耐受性
    4.6 對煤礦瓦斯中甲烷的去除能力
    4.7 甲烷氧化混合菌的保藏方法研究
    4.8 本章小結(jié)
第5章 甲烷氧化混合菌的大規(guī)模發(fā)酵研究
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法與裝置
        5.2.1 種子培養(yǎng)
        5.2.2 5L 發(fā)酵罐培養(yǎng)
        5.2.3 40L-300L 二聯(lián)發(fā)酵罐
        5.2.4 100L-600L 二聯(lián)發(fā)酵罐
    5.3 混合菌在5L 發(fā)酵罐的培養(yǎng)研究
        5.3.1 生長特性
        5.3.2 甲烷去除能力
        5.3.3 菌群變化
    5.4 混合菌放大發(fā)酵研究
        5.4.1 5L-40L-300L 放大發(fā)酵
        5.4.2 5L-100L-600L 放大發(fā)酵
    5.5 本章小結(jié)
第6章 甲烷氧化混合菌治理煤礦瓦斯應(yīng)用研究
    6.1 引言
    6.2 在實(shí)驗(yàn)室模擬煤層中去除甲烷
    6.3 應(yīng)用生物濾器去除甲烷
    6.4 河南煤礦掘進(jìn)煤層注入試驗(yàn)
        6.4.1 禹州市軍陽礦業(yè)礦井中試
        6.4.2 禹州市神火集團(tuán)礦井中試
        6.4.3 河南永錦能源有限公司礦井中試
    6.5 甲烷氧化混合菌治理瓦斯的前景分析
    6.6 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號：2834591