隨著水體富營養(yǎng)化加劇，藻類所引起的水污染問題已越來越引起人們的關(guān)注，藍藻是目前已知產(chǎn)生毒素最多、對人類健康造成的危害最大的藻類。微囊藻毒素-LR(microcystins-LR，MC-LR)是有毒藍藻細胞合成的二級代謝產(chǎn)物，是一種細胞內(nèi)毒素。微囊藻毒素可影響魚類的胚胎發(fā)育和生長，也可引起肝臟、腎臟等內(nèi)部器官的病理變化，和導致魚體的氧化損傷等。然而，有關(guān)微囊藻毒素對魚類分子水平上的毒性效應的研究則很少。本研究以斑馬魚和鳙魚為對象，采用實時熒光定量PCR、分子克隆和免疫印跡技術(shù)在分子水平上揭示了MC-LR對魚類的毒理效應。 本研究中采用人工繁殖的方法收集健康的斑馬魚胚胎，待孵化出膜后，用濃度為200μg／L和800μg／L MC-LR溶液浸泡幼魚進行攻毒實驗。在染毒12h，24h，48h，96h和168h后取樣。用實時熒光定量PCR方法檢測了斑馬魚幼魚的重組激活基因Rag(Rag1，Rag2)、淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、T細胞受體α(TCRα)、轉(zhuǎn)錄因子GATA1、鋅指紋蛋白(Ikaros)和熱休克蛋白基因(HSP90、HSP70、HSP60、HSP27)的表達變化。發(fā)現(xiàn)Rag1、Rag2、LCK、TCRα、GATA1和Ikaros都有表達上升趨勢，特別是在800μg／L MC-LR處理后，在很多時間點內(nèi)表達上升明顯，與對照組有顯著差異(P＜0.05)；熱休克蛋白基因(HSP90、HSP70、HSP60、HSP27)的表達變化更為明顯，在200μg／L和800μg／L MC-LR處理后，所有熱休克蛋白基因的表達均有上升，且差異明顯(P＜0.05)，尤其是HSP70在800μg／L MC-LR處理168h后，其表達量上升了近300倍。這說明MC-LR可影響斑馬魚幼魚早期發(fā)育的重要調(diào)控因子、轉(zhuǎn)錄因子和熱休克蛋白的表達，從而推測MC-LR可能影響斑馬魚的早期發(fā)育和免疫系統(tǒng)功能。 本研究通過分子克隆技術(shù)中的RACE方法獲得了兩個鳙魚去毒酶相關(guān)基因的cDNA全長，并進行了系統(tǒng)進化分析及推導的蛋白質(zhì)序列分析。 谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GPX)基因cDNA全長903個核苷酸(nucleotides，nt)(GenBank accession no．FJ357422)，包含426 nt的開放閱讀框，編碼142個氨基酸，其中5′、3′端非編碼區(qū)分別為182 nt和292 nt，推測GPX蛋白的分子式C_(740)H_(1144)N_(196)O_(213)S_4，分子量為16.3226千道爾頓，等電點5.93，預測該蛋白為水溶性。系統(tǒng)進化分析和氨基酸序列比對的結(jié)果表明，鳙魚GPX與草魚、鰱魚、鮒魚的相似性較高，分別為99.3％，97.9％，93.0％。 谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)基因cDNA全長831個核苷酸(nucleotides，nt)(GenBank accession no．FJ349627)，包含717 nt的開放閱讀框，編碼239個氨基酸，其5′、3′端非編碼區(qū)分別為74 nt和40 nt，推測GR蛋白的分子式C_(1131)H_(1796)N_(324)O_(347)S_7，分子量為25.709千道爾頓，等電點7.71，預測該蛋白為水溶性。系統(tǒng)進化分析和氨基酸序列比對的結(jié)果表明，鳙魚GR與斑馬魚、大西洋鮭相似性較高，分別為90.8％和81.1％。 在健康鳙魚中，對兩個基因轉(zhuǎn)錄和表達產(chǎn)物的器官組織分布進行了詳細的分析。實時熒光定量PCR的結(jié)果表明，GPX和GR在所有被檢測的鳙魚組織中都有表達，呈組成型表達，且具有相似的組織分布模式，即在肝臟中的表達最高，其次是脾臟、鰓、中腎、頭腎等，腦和心臟中的表達較低。分別構(gòu)建GPX和GR基因的原核表達質(zhì)粒pQE40-GPX和pQE40-GR，通過原核表達、表達蛋白純化、并制備多克隆抗體，對腦、鰓、心臟、頭腎、中腎、肝臟、肌肉、脾臟、和胸腺等器官中的目的基因蛋白進行免疫印跡分析。免疫印跡Western blotting結(jié)果顯示GPX蛋白在各個組織中廣泛表達。 經(jīng)腹腔注射MC-LR(50μg／kg body weight)對鳙魚進行染毒實驗，以注射滅菌生理鹽水作為對照，分別于染毒后6h，12h，24h，48h，96h和168h后取處理組和對照組的肝臟、脾臟、頭腎、腸道。用實時熒光定量PCR方法檢測鳙魚的GPX和GR表達變化。發(fā)現(xiàn)在MC-LR誘導后GPX在肝臟、脾臟和頭。腎中過量表達，差異顯著(P＜0.05)；GR在腸道和頭腎中，表達變化顯著(P＜0.05)，上升倍數(shù)較高，而在肝臟和脾臟中GR的表達雖然也是增加的，但變化沒有腸道和頭腎中的明顯。結(jié)果表明，GPX和GR基因在微囊藻毒素的影響下，轉(zhuǎn)錄及表達加強，生成更多的酶蛋白，從而增強機體對微囊藻毒素的解毒能力。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：X174
【部分圖文】：

華中科技大學博士學位論文圖2一 1PCR檢測cDNA模板質(zhì)量 DNAMa坎er為nLZ000，所示條帶從大到小依次為2000、1000、750、500、250不「 1100bp。2.33基因的非特異性檢測目的基因和內(nèi)參基因GAPDH、HSP90、HSP70、HSP60、HSP27的熔解曲線圖見圖2一2、2一3、2一4、2一5和2一6。圖2一23一磷酸甘油醛脫氫酶的熔解曲線二飛殺短令!，empe「ature】圖2一 3HSP90的熔解曲線

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【參考文獻】

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本文編號：2834170