環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals, EDCs)是干擾生物內(nèi)分泌系統(tǒng)功能,特別影響生殖功能的人工或天然化合物。環(huán)境雌激素(Environmental estrogens, EEs)是EDCs中對生物影響最嚴(yán)重的一種,能模擬體內(nèi)天然雌激素并干擾其功能的人工合成的或植物化合物。實驗證明這些物質(zhì)導(dǎo)致動物和人類的生殖功能受損和干擾性別分化。17α-炔雌醇(17α-ethynylestradiol, EE2)是一種常見的EEs,是口服避孕藥的主要成分,通過城市污水處理系統(tǒng)進(jìn)入自然水環(huán)境。在自然水環(huán)境中,EE2的濃度可達(dá)42 ng/L。文獻(xiàn)報道約5.7%的美國河流中含有EE2且濃度超過5 ng/l。由于EE2具有半衰期長和生物富集等特點,魚體內(nèi)EE2的含量可比自然環(huán)境中高數(shù)百至上千倍。魚類暴露于EE2污染的水環(huán)境中引起本不表達(dá)卵黃蛋白原(Vitellogenin, VTG)的雄魚和幼魚表達(dá)VTG并引起性分化異常,雄性個體雌性化和生殖功能異常。鑒于環(huán)境雌激素廣泛存在與嚴(yán)重危害,我們以斑馬魚為模式生物研究環(huán)境雌激素對生殖系統(tǒng)的影響,首先利用環(huán)境雌激素誘導(dǎo)VTG表達(dá)這一特性,克隆VTG的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域,構(gòu)建了對雌激素敏感的可用于直觀檢測環(huán)境雌激素的ere-zvtg1: egfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚系,并對該魚系對雌激素的敏感性和特異性進(jìn)行了研究,并探討其實際應(yīng)用價值。實驗室前期工作對環(huán)境雌激素影響斑馬魚生殖系統(tǒng)形態(tài)的發(fā)育及功能做出了詳細(xì)的研究,本課題對環(huán)境雌激素影響斑馬魚生殖系統(tǒng)發(fā)育的三條可能途徑進(jìn)行了初步實驗研究。環(huán)境雌激素通過與斑馬魚體內(nèi)雌激素受體結(jié)合,并結(jié)合在vtg啟動子上游雌激素反應(yīng)元件上,激活啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄mRNA,表達(dá)卵黃蛋白原蛋白。為了解雌激素受體在外源性雌激素誘導(dǎo)斑馬魚表達(dá)卵黃蛋白原基因并進(jìn)一步干擾斑馬魚性腺發(fā)育中的作用,我們通過雌激素受體的功能抑制或下調(diào)其表達(dá)等方法觀察雌激素受體在外源性環(huán)境雌激素誘導(dǎo)VTG表達(dá)中的作用,實驗和統(tǒng)計表明外源性雌激素作用于斑馬魚的靶點是雌激素受體2b。文獻(xiàn)報道EDCs干擾斑馬魚胚胎原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells, PGCs)的遷移和分布,對斑馬魚的生殖腺發(fā)育造成不利影響。為了研究EEs對斑馬魚原始生殖細(xì)胞遷移的影響,我們用綠色熒光蛋白特異的標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞,用環(huán)境雌激素進(jìn)行處理,結(jié)果表明EE2濃度達(dá)1ug/L時斑馬魚胚胎原始生殖細(xì)胞遷移開始出現(xiàn)異常,這一過程中需要斑馬魚雌激素受體2a參與。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可以誘發(fā)表觀遺傳學(xué)改變,涉及表觀遺傳中重要的lsd1基因,lsdl編碼一種作用于H3K4 (histon 3 lysine 4)的組蛋白脫甲基化酶,H3K4的二甲基化是穩(wěn)定的表觀遺傳學(xué)印記,在線蟲中1sdl基因缺失改變這種表觀遺傳印記,逐代積累導(dǎo)致線蟲的不育。在哺乳動物的睪丸中l(wèi)sd1含量明顯高于其他組織,提示lsd1與精子的形成相關(guān)。環(huán)境雌激素使斑馬魚精子的產(chǎn)生及精子質(zhì)量嚴(yán)重下降,甚至引起不孕不育。1sdl基因表達(dá)改變與環(huán)境雌激素都可以導(dǎo)致生殖異常,這兩種因素是否有交叉作用呢?我們擬用人工鋅指核酸酶技術(shù)對lsdl基因進(jìn)行特異性基因打靶,構(gòu)建lsd1基因缺失斑馬魚系,深入研究lsd1基因的功能,目前已經(jīng)構(gòu)建成功lsdl-人工鋅指核酸酶載體,并證明lsdl-ZFN能在斑馬魚中表達(dá),后續(xù)篩選試驗正在進(jìn)行中。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：X503.225
【文章目錄】：
英文縮略詞表
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 直觀檢測環(huán)境雌激素的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系的建立及其特異性敏感性和應(yīng)用研究
    引言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
第二部分 環(huán)境雌激素17α-炔雌醇對斑馬魚雌激素受體表達(dá)的影響
    引言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
第三部分 環(huán)境雌激素17α-炔雌醇作用靶點的研究
    引言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
第四部分 環(huán)境雌激素17α-炔雌醇對斑馬魚胚胎原始生殖細(xì)胞遷移和分布的影響及雌激素受體在其中的作用
    引言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
第五部分 人工鋅指核酸酶對lsd1特異性基因打靶
    引言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
全文總結(jié)和展望
全文參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文,參加會議及獲獎情況
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝

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本文編號：2831204