白腐菌是自然界中唯一能徹底降解木質(zhì)素的真菌,研究發(fā)現(xiàn)白腐菌對(duì)木質(zhì)素、木質(zhì)素結(jié)構(gòu)類似物具有良好的適應(yīng)性和耐受性,然而白腐菌是如何響應(yīng)木質(zhì)素環(huán)境的研究目前知之甚少。為了深入探究白腐菌對(duì)木質(zhì)素的響應(yīng)機(jī)制,本研究以具有木質(zhì)素降解能力的白腐真菌糙皮側(cè)耳BP2作為研究對(duì)象,對(duì)糙皮側(cè)耳在不同木質(zhì)素體系下的胞內(nèi)蛋白和分泌蛋白表達(dá)差異進(jìn)行分析,并從關(guān)鍵功能基因轉(zhuǎn)錄水平,生物學(xué)特性,木質(zhì)素組分結(jié)構(gòu)變化等方面研究了糙皮側(cè)耳對(duì)不同木質(zhì)素體系的響應(yīng)機(jī)制。主要結(jié)論如下:(1)木質(zhì)素對(duì)糙皮側(cè)耳的氧化脅迫效應(yīng)木質(zhì)素在糙皮側(cè)耳BP2液體培養(yǎng)基中能引起胞內(nèi)氧化過(guò)程相關(guān)蛋白表達(dá)顯著上調(diào),胞內(nèi)氧化水平顯著上升,而同時(shí)戊糖代謝途徑、TCA循環(huán)、糖酵解過(guò)程相關(guān)的酶的表達(dá)受到抑制,導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)緩慢。進(jìn)一步以木質(zhì)素含量分別為36%和20%且富含S型單體結(jié)構(gòu)的兩種硬木,以及木質(zhì)素含量?jī)H為12%缺少S型單體結(jié)構(gòu)軟木作為基質(zhì),研究了糙皮側(cè)耳BP2對(duì)具有不同類型的木質(zhì)纖維素的響應(yīng)差異,結(jié)果顯示硬木培養(yǎng)體系中響應(yīng)木質(zhì)素的氧化過(guò)程相關(guān)蛋白顯著上調(diào),同時(shí)體系內(nèi)氧化水平顯著上升,葡萄糖代謝相關(guān)蛋白顯著下調(diào)。表明木質(zhì)素的存在對(duì)糙皮側(cè)耳具有氧化脅迫效應(yīng),在天然木質(zhì)纖維素中,脅迫程度因木質(zhì)素的含量和結(jié)構(gòu)而異。(2)木質(zhì)素氧化脅迫效應(yīng)啟動(dòng)了糙皮側(cè)耳胞內(nèi)抗氧化脅迫機(jī)制在液體培養(yǎng)體系中,糙皮側(cè)耳BP2胞內(nèi)抗氧化、抗脅迫相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào),超氧化物歧化酶,過(guò)氧化物酶,谷胱甘肽還原酶等活性提高,有效降低細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫和氧自由基水平,使其生長(zhǎng)速率加快,解除了木質(zhì)素的脅迫效應(yīng)。在木質(zhì)纖維素培養(yǎng)體系下也有類似規(guī)律,在硬木中,糙皮側(cè)耳BP2的抗脅迫相關(guān)蛋白以及木糖代謝關(guān)鍵蛋白表達(dá)顯著上調(diào),有效降低體系內(nèi)氧化水平,提高菌絲生長(zhǎng)速率,糙皮側(cè)耳通過(guò)啟動(dòng)抗脅迫機(jī)制和碳源利用策略提高其在硬木中的適應(yīng)性。(3)糙皮側(cè)耳的分泌功能蛋白對(duì)解除木質(zhì)素及其水解產(chǎn)物脅迫有重要作用液體培養(yǎng)體系下,糙皮側(cè)耳BP2分泌蛋白中與木質(zhì)素降解相關(guān)主要有漆酶、芳基醇氧化酶、草酸脫氫酶,在木質(zhì)素存在下表達(dá)顯著上調(diào),起到平衡胞外氧化水平以及降解木質(zhì)素的作用。硬木和軟木培養(yǎng)下,分泌蛋白中與木質(zhì)素降解相關(guān)蛋白多達(dá)27種,硬木中木質(zhì)素酶豐度較高,其中Glass II的過(guò)氧化物酶起主導(dǎo)作用,GMC家族蛋白芳基醇氧化酶、乙二醛氧化酶起到輔助作用,這兩類酶對(duì)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)起到重要修飾和解構(gòu)作用,相同時(shí)間內(nèi)硬木中木質(zhì)素的降解百分率為軟木的兩倍,除此之外,GMC家族蛋白對(duì)提高糙皮側(cè)耳的木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物耐受性具有重要作用。由此可見(jiàn),糙皮側(cè)耳通過(guò)胞外木質(zhì)素降解酶進(jìn)一步解除木質(zhì)素脅迫,增強(qiáng)其對(duì)水解產(chǎn)物的耐受性。綜上所述,該研究創(chuàng)新性地揭示了在木質(zhì)素存在體系下,白腐菌通過(guò)調(diào)節(jié)氧化水平、部分碳水化合物代謝、胞外木質(zhì)素降解酶水平等響應(yīng)方式對(duì)木質(zhì)素環(huán)境從適應(yīng)到降解,最終解除脅迫。相關(guān)研究成果補(bǔ)充與完善了白腐菌降解轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：X71;X172
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文水解產(chǎn)生的纖維二糖和可溶性纖維寡糖，最終將纖維素水解為小分子葡萄糖，實(shí)現(xiàn)結(jié)晶維素的徹底水解[28]。白腐菌改性木質(zhì)素可以將木質(zhì)素水解產(chǎn)物對(duì)環(huán)境的危害降低到最小，被認(rèn)為是目前最安全、無(wú)公害的木質(zhì)素改性方式。白腐菌因其具備獨(dú)特的胞外降解機(jī)制，除了能對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行改性外，還能降解木質(zhì)素結(jié)構(gòu)類似的有機(jī)污染物，因而得到廣泛關(guān)注。白腐菌胞外降解機(jī)制是目前研究較為清楚的，但對(duì)于白腐菌如何使木質(zhì)素高分子發(fā)生解聚從而生成木質(zhì)素單體，進(jìn)而使單體氧化，破壞芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的認(rèn)知有限，對(duì)于機(jī)理的挖掘未能深入（圖 1.1）。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文1.2.4 白腐菌對(duì)木質(zhì)素相關(guān)水解產(chǎn)物的解毒機(jī)制木質(zhì)素及其相關(guān)的其他組分的水解產(chǎn)物中存在大量的抑制微生物生長(zhǎng)的化合物，制約了微生物對(duì)木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化利用效率。通過(guò)物理或者化學(xué)的方法來(lái)解除抑制要耗費(fèi)大量的成本[30]，有背于生物轉(zhuǎn)化的經(jīng)濟(jì)原則。木質(zhì)素是 種不溶于水的類苯基丙烷單體組成的芳香族聚合物。水解處理可能導(dǎo)致木質(zhì)素和糖的進(jìn) 步降解為抑制發(fā)酵的三種主要的化合物，步驟：（I）呋喃衍生物（2-糠醛和 5-羥甲基-2-糠醛）；（II）弱酸（主要是乙酸，甲酸和乙酰丙酸）；和（III）酚類化合物（圖 1.2）。

圖2.1 2-DE圖譜分析木質(zhì)素、半纖維素、CMC液體培養(yǎng)條件下糙皮側(cè)耳BP2胞內(nèi)差異蛋白。箭頭標(biāo)示的為差異蛋白。（A）Krik 培養(yǎng)基（對(duì)照）；（B）添加木質(zhì)素；（C）添加木聚糖；（D）添加纖維素。等點(diǎn)聚焦 pH 范圍為 4-7，蛋白分子量標(biāo)注在圖表左側(cè)。Fig 2.1 2-DE analysis of differential expressed proteins in P. ostreatus grown in liquid substratesupplemented with different components of lignocellulose. Arrows and numbers refer to differentiexpressed proteins (A) Kirk’s liquid medium(control). (B) Kirk’s liquid medium supplemented witlignin;(C) xylan;(D) CMC. The pH of the isoelectric focusing gel ranging from 4 to 7 is shown on thtop of each gel. Molecular weight (MW) is shown on the left of the gels.差異蛋白根據(jù)功能及參與代謝途徑可以分為以下六類（表 2.2）：（1）氧化還原蛋白，這類蛋白主要參與細(xì)胞內(nèi)氧化還原過(guò)程；（2）脅迫響應(yīng)蛋白。這類蛋白受細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)調(diào)控，包括應(yīng)激蛋白和抗氧化蛋白，在細(xì)胞受到外界刺激后，起到防止細(xì)胞損傷的作用。（3）碳水化合物和能量代謝相關(guān)蛋白。這類蛋白參與碳水化合物代謝，為細(xì)胞提供能量，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。這類蛋白在總蛋白中豐度最高，

【參考文獻(xiàn)】

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