微生物Fe(Ⅲ)還原作用能以Fe(Ⅲ)作為電子受體,將有機或無機的電子供體氧化。自然界的厭氧環(huán)境幾乎都有異化Fe(Ⅲ)還原現(xiàn)象,并有鐵還原微生物存在。關(guān)于水稻土微生物鐵還原過程的知識在最近十年里持續(xù)的增加。然而因為鐵還原微生物系統(tǒng)發(fā)育學上的多樣性和鐵還原途徑的不確定性,使得人們對鐵還原微生物的認識僅限于幾類典型的物種,如Geobacter和Shewanella。水稻土水旱輪作的耕作方式作為研究氧化還原過程的一種模式系統(tǒng)一直受到人們的重視,其中鐵的氧化還原占有重要地位。但對其淹水厭氧狀態(tài)下微生物群落的分布演替的知識甚少,缺乏對鐵還原過程具有貢獻率的細菌的相關(guān)報道。所以,研究不同碳源富集下水稻土中Fe(Ⅲ)微生物的優(yōu)勢類型,不僅可深化對水稻田微生物生態(tài)的認識,而且對于闡明水稻土微生物Fe(Ⅲ)還原機理及群落演替特征具有重要的意義。 本文采用厭氧恒溫培養(yǎng)方法,在自然和有機質(zhì)耗竭水稻土中添加無定形氧化鐵和不同碳源進行富集馴化,分析鐵還原特征;進一步分離篩選出具有高效鐵還原能力的菌株,采用16S rDNA-ARDRA分子生物學技術(shù)對其多樣性進行分析評價;并對典型菌株進行16S rDNA序列測定。直接分離純化鐵還原環(huán)境下水稻土中的微生物,通過直接測定其16S rDNA序列,認識其在系統(tǒng)分類學上的歸類。比較不同淹水時間及在外加碳源和鐵源馴化下微生物群落結(jié)構(gòu)的差異,分析其優(yōu)勢種群的演替特征。提取來源不同植稻區(qū)水稻土不同淹水時期的微生物群落,接種于以不同碳源為惟一底物的富鐵培養(yǎng)液中,定期測定Fe(II)生成量,pH變化及脫氫酶活性,探索鐵還原微生物的活性出現(xiàn)的最大時期及穩(wěn)定期,以得到鐵還原微生物活性恢復最快的時期,為研究不同水稻土微生物鐵還原能力差異和影響因素提供基礎(chǔ)依據(jù)。通過對微生物Fe(Ⅲ)還原過程和脫氫酶活性變化的動力學特征分析,以期闡明脫氫酶活性與微生物Fe(Ⅲ)還原的內(nèi)在關(guān)系,為揭示水稻土中微生物Fe(Ⅲ)還原機理提供必要的理論依據(jù)。本論文的主要結(jié)果包括以下方面: (1)在有機質(zhì)耗竭水稻土中添加葡萄糖和丙酮酸鹽后,其鐵還原反應的趨勢跟自然水稻土比較接近,而添加乙酸鹽的處理則表現(xiàn)出一定差異。表明淹水水稻土中鐵還原反應在初期的快速進行是由利用葡萄糖的發(fā)酵產(chǎn)H2型鐵還原菌所主導的,淹水后期的鐵還原反應則是由利用乙酸鹽的鐵還原菌所控制。H2-依賴型鐵還原菌對水稻田中的鐵還原過程的貢獻大于乙酸依賴性。 (2)鐵還原微生物群落組成與結(jié)構(gòu)是影響水稻土中鐵還原過程的重要因素。在接種土壤浸提液的混合培養(yǎng)中,不同淹水時期對Fe(Ⅲ)還原特征值Vmax的影響顯著,表現(xiàn)為淹水20 d30 d12 d1 d5 d,水稻土中微生物群落結(jié)構(gòu)變化是導致Fe(Ⅲ)還原能力不同的主要原因。不同淹水時期得到的鐵還原微生物群落對碳源的響應具有顯著差異,淹水1~12 d的處理以葡萄糖和丙酮酸鹽為優(yōu)勢碳源,淹水12 d和20 d的處理能夠高效利用乳酸鹽,淹水30 d的處理對乙酸鹽的利用能力顯著增強。 (3)檸檬酸鐵的生物還原和化學還原具有顯著的不同,光照和高溫是影響檸檬酸鐵化學還原的主要原因,避光和30℃培養(yǎng)條件不會造成檸檬酸鐵的化學還原。本試驗條件下的接種了微生物的檸檬酸鐵還原主要是由微生物引起的。建立了有效篩選鐵還原菌株的分離培養(yǎng)方法體系,判定ferrihydrite還原率在50%以上的菌株為高效鐵還原菌。在不同碳源富集下,從吉林,四川,湖南,浙江,天津和江西水稻土獲得高效鐵還原菌株分別為88,54,161,88,33和67個。 (4)α多樣性指數(shù)表明在葡萄糖富集下出現(xiàn)較為集中的優(yōu)勢種群,而在小分子有機酸為碳源的處理中則呈現(xiàn)出較為豐富的多樣性。在HN水稻土中,基于16S rDNA-ARDRA分析,其優(yōu)勢種屬一共分為7類。不同碳源富集下都均有Paenibacillus spp.和Clostridium.spp.出現(xiàn);Solibacillus和Lysinibacillus是乙酸鹽富集下的優(yōu)勢種群,而Bacillus則是丙酮酸鹽富集下的優(yōu)勢種屬;除了葡萄糖處理,其他碳源富集及對照中都表現(xiàn)出Azotobacter為其優(yōu)勢物種;而Pseudomonas spp.作為優(yōu)勢物種只出現(xiàn)于葡萄糖富集的群落中。 (5)微生物Fe(Ⅲ)還原過程對脫氫酶活性具有明顯的影響,不同處理中脫氫酶活性最大值對應的Fe(II)含量為91.0~344.6 mg·L-1,隨著鐵還原程度的繼續(xù)增大,脫氫酶活性隨之降低。不同處理中脫氫酶活性與微生物Fe(Ⅲ)還原過程具有相關(guān)性,脫氫酶活性峰值出現(xiàn)時間與Fe(OH)3還原TVmax具有顯著正相關(guān)關(guān)系,而與Vmax則表現(xiàn)為明顯負相關(guān)。脫氫酶活性是影響水稻土中鐵還原過程的重要因素,推測微生物代謝有機物產(chǎn)H2是水稻土淹水初期鐵快速還原的主要原因。 (6)自然淹水條件下,水稻土中早期出現(xiàn)的可分離株采用r-策略進行生殖生長,物種多樣性相對豐富,可歸屬于Lysinibacillus,Staphylococcus,Paenibacillus和Azotobacillus的系統(tǒng)發(fā)育分支上;演替后期鐵還原過程進入平穩(wěn)階段且出現(xiàn)相對集中的類群,主要以Bacillus spp.為優(yōu)勢物種代表。在外加碳源和氧化鐵富集下,水稻土中可分離株的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變異。 通過本文的研究,對不同碳源富集下水稻土中優(yōu)勢鐵還原菌的種屬以及鐵還原環(huán)境下的微生物群落的演替有了更為深入的認識,探討了脫氫酶活性跟微生物鐵還原過程之間的聯(lián)系,為進一步明確我國水稻土淹水培養(yǎng)后鐵還原菌群落結(jié)構(gòu)特征及系統(tǒng)分類、探討不同水稻土中微生物鐵還原能力差異提供基礎(chǔ)依據(jù),也對水稻土微生物Fe(Ⅲ)還原機理提出了初步的構(gòu)想。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：X172
【部分圖文】：

圖 3-6 不同淹水時間處理不同水稻土的兩維圖論聚類分析Fig. 3-6 Two-dimensional graphic cluster of paddy soils in different flooding time treatments3.2.5 鐵還原條件下利用不同碳源的 pH 變化土壤浸提液試驗中，不同淹水時期得到的微生物群落利用外加碳源及對照體系中pH 值變化見圖 3-7 至 3-11。當培養(yǎng)體系中沒有添加碳源時，對應各土壤不同淹水時期處理中幾乎無 Fe(II)產(chǎn)生，其 pH 基本維持在初始的中性 pH（圖 3-7），說明在無碳源供給的情況下，微生物的生理代謝反應停滯；同時也表明 Fe(III)還原過程是在微生物作用下的酶促反應，當鐵還原微生物的活性鈍化時，F(xiàn)e(III)還原反應不能正常進行。0 10 20 30 40 506.87.27.68.08.4 1 dJL Ck5 d12 d20 d30 dHp0 5 10 15 20 25 306.87.27.68.08.4TJ Ck1 d5 d12 d20 d30 dHp

Fe(II)生成量測定方法用自動加樣器吸取 1 mL 培養(yǎng)樣品置于含 4 mL 0.5 mol L-1HCl 的聚乙烯管中下浸提 24 h(Schnell and Ratering 1998)，每個處理設(shè)置 3 個平行。測定方法同 2結(jié)果與分析 厭氧富集條件下可培養(yǎng)微生物的長勢厭氧泥漿培養(yǎng)條件下，接種了不同碳源富集處理液接種的固體平板基上的菌落 4-1 所示。

將得到的 Fe(OH)3鐵還原率大于 50%的菌株接種到含有 Fe(OH)3的液體培養(yǎng)基（圖4-4A）以及斜面固體培養(yǎng)基（圖 4-4B）進行穿刺試驗。如圖 4-4A 所示，從左至右所示為接種了鐵還原菌的紅棕色 Fe(OH)3培養(yǎng)液逐漸還原為無色亞鐵的過程；圖 4-4B 顯示了將鐵還原菌穿刺到 Fe(OH)3固體培養(yǎng)基后，與不接種的對照試管相比，一定培養(yǎng)時間內(nèi)培養(yǎng)基顏色消退變淺，再次驗證本方法體系下篩選得到的菌株是高效鐵還原菌。AB圖 4-4 鐵還原菌的液體培養(yǎng)試驗（A）和穿刺試驗結(jié)果（B）Fig. 4-4 Results of iron reducers in a liquid culture test (A) andPuncture test (B)4.3 討論傳統(tǒng)上，鐵還原菌的定義是在厭氧條件下，能以三價鐵作為電子受體氧化有機物獲得能量支持生長的微生物，但對“三價鐵”的定義卻沒有嚴格的定義。在自然界中，鐵很少以純凈的晶體態(tài)形式(Kappler and Straub 2005)，大部分是和其他元素共存形成氧化礦物或形成有機螯合物以及納米顆粒聚合物類似的膠體。如此復雜的自然體系提供了各種各樣的微生態(tài)環(huán)境，這也就導致了許多鐵還原菌在實驗室條件下生長不好的原因。其中最主要的因素是鐵在中性pH環(huán)境下呈現(xiàn)固態(tài)，從而不容易和微生物直接接觸。為了克服克服中性pH條件下Fe(III)的不可溶性，許多研究通過添加螯合劑來溶解Fe(III)，如用檸52

【引證文獻】

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1 宋建瀟;吳超;曲東;;有機碳源對水稻土中微生物鐵還原特征的影響[J];農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報;2013年02期

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本文編號：2821388