銅綠微囊藻Microcystis aeruginosa PCC7806是一種單細(xì)胞的浮游藍(lán)藻,它可在淡水水體表面季節(jié)性聚集暴發(fā)水華。例如,我國(guó)的太湖和巢湖近年常暴發(fā)藍(lán)藻水華,而銅綠微囊藻就是形成水華的最優(yōu)勢(shì)藻種。銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)能大量產(chǎn)生一種亞細(xì)胞器,叫做氣囊。氣囊是一種中空、充滿氣體的惰性結(jié)構(gòu),它完全僅由蛋白質(zhì)組成。氣囊的作用就是可以通過(guò)降低藻細(xì)胞的密度為其提供浮力,這樣藍(lán)藻可以自行調(diào)節(jié)在自然水體中的垂直位置,它們可以漂浮到水體中氧氣和光照都適宜的位置以利于自身的生長(zhǎng)和后續(xù)的生境殖民化。所以氣囊的存在是銅綠微囊藻能成為優(yōu)勢(shì)藻種的重要原因之一。研究氣囊的特性對(duì)治理藍(lán)藻水華暴發(fā)有一定的理論指導(dǎo)意義。 目前研究已證實(shí)氣囊的合成涉及8-14個(gè)不同的氣囊蛋白Gvp (gas vesicle proteins),這些Gvp蛋白是由gvp基因簇編碼的,而gvp基因簇被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于產(chǎn)氣囊的細(xì)菌和古細(xì)菌中。現(xiàn)已鑒定銅綠微囊藻M. aeruginosa PCC7806氣囊合成基因簇大小是8.7kb,包含有12個(gè)gvp基因。其中的10個(gè)基因分別組成兩個(gè)操縱子,它們是gvpAⅠAⅡAⅢCNJX和gvpKFG。剩下的兩個(gè)基因gvpV和gvpW是獨(dú)自表達(dá)的。GvpA和GvpC被廣泛研究,它們是氣囊的主要結(jié)構(gòu)組成蛋白。分子量較小(7-8kDa)且疏水很強(qiáng)的蛋白GvpA構(gòu)成氣囊壁上的棱紋結(jié)構(gòu),它是氣囊的最主要結(jié)構(gòu)蛋白。而分子量較大的、較親水的次要結(jié)構(gòu)組分蛋白GvpC則是位于氣囊壁的最外表面,通過(guò)與GvpA相互作用來(lái)穩(wěn)定氣囊的結(jié)構(gòu)。除了gvpA和gvpC編碼的兩個(gè)蛋白GvpA和GvpC是氣囊的結(jié)構(gòu)組成蛋白外,藍(lán)藻中其它的gvp基因和Gvp蛋白也可能涉及參與氣囊的合成。 本研究中,我們通過(guò)單波長(zhǎng)散射法解析了銅綠微囊藻M. aeruginosa PCC7806中氣囊基因gvpF編碼的氣囊蛋白GvpF的晶體結(jié)構(gòu),分辨率是2.7A。這是第一個(gè)被解析的氣囊蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)。分析GvpF的三維結(jié)構(gòu)可得知,GvpF是由結(jié)構(gòu)上完全不同的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,分別命名為N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的整體折疊類型都屬于α+β家族。其中,將N端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與α+β家族的其它蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,可看出N端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)折疊模式與其它蛋白都不一樣,它采取的是一個(gè)新的折疊方式。而C端結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)改變了的鐵氧還蛋白折疊的結(jié)構(gòu)類型,與正常的鐵氧還蛋白折疊的結(jié)構(gòu)相比,C端結(jié)構(gòu)域一個(gè)明顯的變化就是多了一個(gè)由三股連續(xù)螺旋構(gòu)成的一個(gè)延伸結(jié)構(gòu)。N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域彼此相對(duì)排列,GvpF的C末端的“尾巴”結(jié)構(gòu)通過(guò)分別與N、C端結(jié)構(gòu)域相互作用來(lái)穩(wěn)定GvpF的整體結(jié)構(gòu)。同時(shí),我們將GvpF的整體結(jié)構(gòu)做Dali搜索,與PDB中的其它結(jié)構(gòu)做結(jié)構(gòu)比對(duì),并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同源結(jié)構(gòu)。由這幾個(gè)方面,我們認(rèn)為GvpF的三維結(jié)構(gòu)是一個(gè)新穎的結(jié)構(gòu)。 同時(shí),我們純化出銅綠微囊藻M. aeruginosa PCC7806的氣囊,負(fù)染電鏡觀察氣囊的結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)圓柱體狀。氣囊的直徑都是相似的,大概120nm,長(zhǎng)度從500nm到1500nm不等。氣囊壁的外表面也可以觀察到等距相間排列的棱紋結(jié)構(gòu)。SDS-PAGE凝膠電泳和質(zhì)譜都只檢測(cè)到純化的氣囊中的結(jié)構(gòu)蛋白GvpC的存在。而蛋白質(zhì)印跡法和免疫膠體金實(shí)驗(yàn)以及基于免疫膠體金的斷層成像技術(shù)均證明GvpF是氣囊的一個(gè)結(jié)構(gòu)組成蛋白,而且是定位在氣囊壁的內(nèi)表面即朝向氣體的一面。 為了獲取其它Gvp蛋白的結(jié)構(gòu)和功能信息,我們也一一表達(dá)純化了其它Gvp蛋白。除了GvpA是包涵體表達(dá)外,其它Gvp蛋白均有上清表達(dá)。通過(guò)純化結(jié)晶摸索,我們獲得了GvpC和GvpW的晶體,但是GvpC晶體不衍射且不易重復(fù),而GvpW晶體的衍射只有十幾埃,晶體優(yōu)化還在進(jìn)行。同時(shí)我們也初步證明了GvpN是一個(gè)ATPase酶。我們還在努力希望能獲得這些Gvp蛋白的晶體,通過(guò)解析它們的三維結(jié)構(gòu),結(jié)合結(jié)構(gòu)來(lái)探索驗(yàn)證它們的功能。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：X52;Q946
【部分圖文】：

甚至威脅著人類的生命安全。我們主要的研究對(duì)象銅綠微囊藻(圖1.1)，英文全名是strain PCC 7806,屬于藍(lán)藻門(mén)，藍(lán)藻綱，色球藻目，色球藻科，微囊藻屬(Komdrek& Anagnostidis，1999)。藻細(xì)胞一般呈球形，直徑3?7 lain，藍(lán)綠色，一般具偽空胞。幼體呈球形或?qū)嵭牡膱A形群體，后逐漸長(zhǎng)成膠被呈透明無(wú)色的網(wǎng)狀膠群體。銅綠微囊藻一般生長(zhǎng)于淡水湖泊中，能代謝生物毒素，是水華暴發(fā)的優(yōu)勢(shì)種類。丨1煖ifilIPp

圖1. 2 2007年太湖銅綠微囊藻水華暴發(fā)(Guo, 2007)3藍(lán)藻水華的機(jī)理前對(duì)于藍(lán)藻形成優(yōu)勢(shì)暴發(fā)水華的機(jī)理有以下幾方面的理論假說(shuō)(Dokulilbner, 2000)：一，高溫能引起藍(lán)藻的快速增長(zhǎng)特別是在夏天，因?yàn)橄鄬?duì)于其它藻類類，一般高溫是藍(lán)藻生長(zhǎng)的最適條件之一。這個(gè)結(jié)論己經(jīng)被很多這個(gè)研宄領(lǐng)用實(shí)驗(yàn)證實(shí)。二，低的光能需求被認(rèn)為能操縱藍(lán)藻水華的形成。這個(gè)理論主要是通過(guò)物種的藍(lán)藻進(jìn)行生理研究而得到的。三，強(qiáng)大的無(wú)機(jī)碳攝取動(dòng)力學(xué)(低C02/高PH假說(shuō))被研究認(rèn)為是藍(lán)藻形成機(jī)制之一。在含堿度低的湖泊中，C02的可獲取不會(huì)使藍(lán)藻達(dá)到最大量但持它們的生存。四，低的氮a惐榷雜詮痰蚍槍痰對(duì)宓男緯啥際怯幸嫻�。灾冃些情魁_閉飧雋俳綾卻锏蕉欽飧霰戎當(dāng)舊磯雜諞恢只蛘吡硪恢?jǐn)S對(duì)逭加攀破鸕

本文編號(hào)：2820653