隨著社會經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展,人類活動造成的多環(huán)芳烴(PAHs)污染越來越嚴(yán)重。這類物質(zhì)具有致畸、致癌、致突變的潛在危害,對生態(tài)環(huán)境和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。生物降解是去除環(huán)境中PAHs的最主要、最有效的途徑,微生物在PAHs降解過程中起著非常重要的作用。從復(fù)雜的環(huán)境樣品中將功能微生物分離出來,并對其進(jìn)行詳細(xì)完整的遺傳、代謝分析,一直以來是環(huán)境微生物學(xué)研究中遇到的最大的挑戰(zhàn)之一。利用傳統(tǒng)的分離方法可直接從環(huán)境樣品中篩選出功能微生物,并可對其形態(tài)特征、生理生化特征、代謝以及遺傳信息進(jìn)行研究。然而該方法只能從環(huán)境中獲得不到1%的微生物,因而存在很大的局限性。此外,純培養(yǎng)條件下生態(tài)位的改變、共代謝及群體感應(yīng)系統(tǒng)的崩潰等因素也會導(dǎo)致微生物的可培養(yǎng)性降低。因此,急需新的生物學(xué)方法克服這一技術(shù)瓶頸。本文應(yīng)用DNA穩(wěn)定同位素探針(SIP)聯(lián)合高通量測序技術(shù)鑒定參與石油污染水體中菲降解的功能微生物種群,同時利用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法分離菲降解菌;隨后,將分離獲得的關(guān)鍵細(xì)菌應(yīng)用于原污染水體生物修復(fù),明確其與功能微生物群落的相互作用機(jī)制,以期在原位條件下達(dá)到最佳修復(fù)效果;另外,我們應(yīng)用原位根際SIP技術(shù)探究根系分泌物和根際作用對污染土壤中PAHs降解微生物的影響,探究根系分泌物在原位植物根際修復(fù)過程中的作用;最后,鑒于SIP在識別功能微生物時出現(xiàn)的低分辨率問題,我們將SIP結(jié)合磁性納米顆粒介導(dǎo)分離(MMI)技術(shù),即MMI-SIP技術(shù),對PAHs污染水體中的菲降解功能微生物進(jìn)行鑒定和分離,以期在復(fù)雜體系中更精準(zhǔn)地識別功能微生物。主要結(jié)論如下:(1)應(yīng)用DNA的穩(wěn)定同位素探針(DNA-SIP)和高通量測序技術(shù),對石油污染水體中參與菲降解過程功能微生物種群進(jìn)行原位探查,并將探查結(jié)果與室內(nèi)培養(yǎng)分離實驗結(jié)果相對照,成功確認(rèn)、分離出一株在污染水體中原位降解菲的高效菌株。研究中,DNA-SIP結(jié)果表明,參與菲降解的土著功能微生物包括Acinetobacter、Sphingobium、Kouleothrix和Sandaracinobacter,其中Kouleothrix和Sandaracinobacter對菲的降解能力首次得到證實。通過優(yōu)化各種實驗條件,成功分離獲得在原位條件可降解菲的新菌株Acinetobacter tandoii sp.LJ-5,該菌可通過β-ketoadipate途徑降解菲。該項工作為原位功能微生物的探查和分離確認(rèn),提供了一個成功的技術(shù)范例。(2)添加LJ-5能夠顯著增加菲的生物降解效率,然而DNA-SIP結(jié)果顯示LJ-5并沒有參與菲的降解,菲降解效率的提高主要是由于添加LJ-5改變了原體系中的土著功能微生物群落,增加了功能微生物群落的多樣性。未接種LJ-5時,PAHs污染水體中的土著功能微生物主要為Rhodoplane、Mycobacterium、Xanthomonadaceae和Enterobacteriaceae,添加菌株LJ-5后,除了Mycobacterium和Enterobacteriaceae保持菲降解功能外,另五種不同的菌群Bacillus、Paenibacillus、Ammoniphilus、Sporosarcina和Hyphomicrobium表現(xiàn)出菲降解能力。另外,功能基因的變化也佐證了以上的結(jié)論。該結(jié)果為微生物強化污水處理作用機(jī)制提供了一個全新的解釋,為石油污染水體生物修復(fù)提供了技術(shù)支持和理論依據(jù),同時也為污染水體中PAHs降解功能微生物群落的多樣性提供了更全面的認(rèn)識。(3)黑麥草根際作用能夠提高菲的生物降解能力,但是實驗證明并非根系分泌物促進(jìn)了菲的生物降解,根系分泌物在PAHs根際生物修復(fù)過程中只起了很小的作用。結(jié)合原位根際SIP和功能基因的定量結(jié)果發(fā)現(xiàn),功能基因和菲降解菌的豐度與菲降解效率之間均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。鑒定的所有功能微生物來自八個綱(Class),其中Alphaproteobacteria和Nitrososphaeria均存在于未處理土壤(AD)、根際處理土壤(RG)和根系分泌物處理土壤(RE)中,Sphingobacteriia和Actinobacteria分別存在于AD+RG、RG+RE兩個處理組中,其他的四種功能微生物群落僅存在于AD或者RE中。以上發(fā)現(xiàn)說明來源于同一土壤的微生物其功能會隨著所處環(huán)境的變化而變化。在所有探查出的功能微生物中,Blastomonas、Sphingoaurantiacus、Ramlibacter、Mucilaginibacter、Pedobacter、Nitrososphaera、Pyrinomonadaceae、Chitinophagaceae和Chthoniobacteraceae對菲的降解能力首次得到證實。本研究明確了根系分泌物在根際生物修復(fù)PAHs過程中的作用,為PAHs污染的原位植物修復(fù)提供了理論依據(jù),同時也為PAHs降解過程中根際菲降解微生物群落多樣性提供了更全面的認(rèn)識。(4)將MMI和SIP技術(shù)結(jié)合發(fā)展出一種新型MMI-SIP方法,用于從PAHs污染水體中鑒定和分離菲降解功能微生物。SIP結(jié)果表明,參與菲降解的功能微生物為Pseudomonas和Sphingobium;與MMI技術(shù)結(jié)合后,MMI-SIP不僅能夠顯著增加Pseudomonas和Sphingobium在~(13)C-DNA中的富集,同時識別出另一種菲降解菌Pigmentiphaga。我們的研究結(jié)果表明,MMI-SIP是一種能夠從復(fù)雜的微生物群落中識別出不可培養(yǎng)功能微生物的方法,與MMI或SIP相比,MMI-SIP具有更高的分辨率和準(zhǔn)確性。同時,功能基因的富集趨勢進(jìn)一步證實了以上結(jié)論。此外,該方法通過MMI技術(shù)成功地分離出菲降解功能微生物并顯著增加PAHs污染水體的菲生物降解效率。本研究表明MMI-SIP技術(shù)是一種具有高分辨率的功能微生物識別工具,可以準(zhǔn)確地從復(fù)雜微生物群落中分離鑒定活性菲降解微生物群落。該結(jié)果為能降解其他有機(jī)污染物的功能微生物識別提供更高的準(zhǔn)確度和分辨率,有助于更精確地探討它們在污染物降解過程中的生態(tài)作用和影響因素。綜上所述,結(jié)合穩(wěn)定同位素探針和高通量測序技術(shù),能夠有效地原位探查污染環(huán)境中參與菲降解過程的功能微生物種群,并利用純培養(yǎng)方式成功確認(rèn)、分離出一株在污染水體中原位降解菲的高效菌株;該菌株能夠通過改變功能微生物群落,增加功能微生物群落的多樣性來促進(jìn)多環(huán)芳烴污染物的微生物降解;同時,發(fā)展了原位根際SIP技術(shù)清晰地闡明根系分泌物在根際微生物修復(fù)PAHs污染物過程中的作用;為提高SIP技術(shù)在功能微生物識別方面的分辨率,本文大膽地將以上SIP技術(shù)與MMI技術(shù)相整合,大大提高了SIP技術(shù)在功能微生物探查方面的精準(zhǔn)性,是相關(guān)研究領(lǐng)域一項典型的創(chuàng)新工作。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：X592;X172
【部分圖文】：

圖 1-1 菲的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Figure 1-1 Chemical structure of phenanthrene夠分泌大量的氨基酸、有機(jī)酸等化合物，為微珠, 2008)。此外，這些根系分泌物能夠改變土機(jī)物污染物的生物降解產(chǎn)生影響。2011 年, C染土壤中添加根系分泌物探究其對菲降解功能

圖 2-7 (a) 固體培養(yǎng)基上生長的 LJ-5 單菌落 (b) LJ-5 透射電子顯微鏡圖：無鞭毛，比例尺為 0.5 和 1 μm。Figure 2-7 (a) Photograph of LJ-5Tcolonies on LB media plate; (b) Electron micrograph of cellsof strain LJ-5T. Bar, 500 nm (left) and 1000 nm (right).如圖 2-8 所示，在相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，LJ-5 能夠在 25-40 ℃溫度范圍內(nèi)生長，最適生長溫度為該菌的富集溫度 30 ℃；該菌能夠在 5.0-9.0 的 pH 條件下生長，最佳生長 pH 為 7.0；LJ-5 的鹽耐受能力較弱，只能在鹽濃度為 0-3%的條件下生長，且在 0%的鹽濃度下長勢最好。0.20.40.60.81.01.20.20.40.60.81.01.21.41.60.70.80.91.01.11.21.3Opticaldensity(OD600)

圖 2-9 LJ-5 和其相關(guān)菌的基于 16s rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，構(gòu)建方法為鄰接法，自展值設(shè)定重復(fù) 1000 次，圖中僅展示了自展值大于 50 %的結(jié)果，比例尺 0.01 代表每個核苷酸的替換率。Figure 2-9 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequences showing the phylogeneticposition of A. tandoii LJ-5 and representatives of other related taxa. Bootstrap values >50% areshown at the branch points. Bar 0.01 substitutions per nucleotide position.根據(jù)以上實驗結(jié)果，確定了菌株 LJ-5 的最佳生長。該菌株在不同菲濃度（100-1000 mg/Ｌ）中的生長及降解實驗均在這個條件下進(jìn)行。圖 2-10 顯示了菌株 LJ-5 在不同濃度菲的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長曲線及降解特效率。結(jié)果表明，LJ-5 能夠在高濃度菲條件下生長。在菲初始濃度較低（100 到 200 mg·L-1）的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng) 3 天后，其降解率均可達(dá)到 80%以上；在菲初始濃度在 400到 1000 mg·L-1的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng) 7 天后，降解率均可達(dá)到 60%以上。以上結(jié)果說明菌株 LJ-5 是一種能降解菲且耐受菲能力很強的菌株。另外，

本文編號：2815528