近年來,環(huán)境污染問題已成為全球三大危機之一。各種污染物的大量排放給我們的生存環(huán)境產(chǎn)生了巨大影響,而目前對大量污染物的分布情況尤其是其毒性仍不清楚,無法有效評價污染物對生態(tài)環(huán)境的影響。傳統(tǒng)的生物毒性測試方法是基于單一毒性終點(致死、抑制生長等)對污染物的環(huán)境效應(yīng)進行評估。而單指標毒性測試方法很難準確反映污染物對環(huán)境的全部影響。因此,發(fā)展多水平和多指標的毒性測試方法對明確污染物毒性效應(yīng),評估化學品的環(huán)境風險具有重要意義。本文針對目前常規(guī)生物毒性測試存在的問題,建立了基于傅里葉變換紅外光譜的生物毒性測試方法。通過對樣品固定方式和儀器測量方法等的優(yōu)化,與傳統(tǒng)毒性測試方法進行比較,論證了運用傅里葉變換紅外光譜進行生物毒性測試的可行性。并進一步從生物大分子水平入手,運用傅里葉變換紅外光譜,并結(jié)合細胞毒理學研究方法,對離子液體毒性效應(yīng)及作用機制進行了深入分析。所取得的主要進展包括:(1)優(yōu)化了傅里葉變換紅外光譜生物毒性試驗的前處理方法和分析測試方法。本文選取三種常用的生物樣品固定液(70%乙醇、卡洛氏溶液、10%福爾馬林溶液),對紅外光譜生物毒性測試的前處理方法進行比較,結(jié)果表明:卡洛氏溶液對生物分子的影響最為顯著,70%乙醇固定方法會溶解細胞內(nèi)脂質(zhì)物質(zhì)從而影響對脂質(zhì)分子的研究,而10%中性福爾馬林溶液對樣本進行固定后,在生物大分子水平上的變化情況最小。通過比較測量模式和調(diào)試生物樣品紅外光譜測量參數(shù)發(fā)現(xiàn),當設(shè)置分辨率為8 cm~(-1),掃描次數(shù)為64,以透射模式對浮萍樣品進行紅外光譜掃描可以獲得較為豐富和準確的生物大分子信息。(2)在污染物毒性測試研究中,分析了有機助溶劑的使用對毒性效應(yīng)的影響。結(jié)果表明:乙醇和甲醇兩種有機溶劑,即使處理濃度很小,也會對浮萍和綠藻的生長及生物大分子水平產(chǎn)生影響;丙酮在OECD建議濃度(0.01%v/v)下毒性效應(yīng)較小;相比于其他溶劑,DMSO在劑量低于0.1%v/v時對浮萍的影響較小。因此,在水生生物毒性測試研究中,甲醇和乙醇不宜作為有機助溶劑,而0.1%v/v濃度下的DMSO是較為合適的有機助溶劑。(3)以重金屬離子(Cu和Cd)和農(nóng)藥(阿特拉津和乙草胺)為目標化合物的浮萍生物毒性測試中,通過對傅里葉變換紅外光譜毒性測試方法與傳統(tǒng)毒性測試方法進行對比研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),基于浮萍的傅里葉變換紅外光譜的生物毒性測試方法具有較高的額靈敏度,同時能獲得受試生物在外界刺激下機體內(nèi)生物大分子的變化信息。通過綜合分析脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA和多糖等生物大分子的變化情況,能夠更加準確地檢測和評估污染物的毒性效應(yīng)。此外,金屬和農(nóng)藥的聯(lián)合毒性評價發(fā)現(xiàn):重金屬離子和農(nóng)藥由于各自作用方式的不同,對受試生物的聯(lián)合毒性效應(yīng)也各不相同。在環(huán)境樣品的生物毒性測試研究中,由于不同樣品中污染物成分和濃度不同,對受試生物的影響不相同,與受試生物相互作用時引起生物體內(nèi)大分子的變化也不相同,根據(jù)生物大分子的變化信息可以推測引起受試生物毒性效應(yīng)的化合物作用方法,進而為環(huán)境樣品的生物毒性測試提供方向。(4)通過傅里葉變換紅外光譜對咪唑類離子液體的毒性進行了研究。以不同烷基鏈長度的咪唑氯鹽為研究對象,大腸桿菌、羊角月牙藻和Hela細胞作為受試生物,分析了離子液體在不同處理濃度和不同烷基鏈長度下對受試生物的毒性效應(yīng)差異和變化規(guī)律。另外,基于不同處理濃度和烷基鏈長度下受試生物細胞內(nèi)生物大分子的變化情況以及對生物大分子(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA)的光譜信息分析探討了其可能的毒性作用機制。研究發(fā)現(xiàn),當受試生物與離子液體相互作用時,主要通過誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生活性氧,通過產(chǎn)生過量的活性氧對細胞膜和細胞器膜產(chǎn)生氧化性損傷,從而影響細胞的流動性和通透性;ROS通過與細胞膜蛋白、功能性蛋白及酶蛋白等相互作用,可以氧化性修飾蛋白質(zhì)上的氨基酸側(cè)鏈殘基以及造成肽鍵斷裂,主要是針對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、氨基酸殘基及蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平等的影響;ROS通過與DNA分子相互作用,對DNA分子的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。通過誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,進而對細胞器及生物大分子產(chǎn)生氧化性損傷,最終導(dǎo)致受試生物的增殖抑制或者死亡。(5)研究了不同濃度和烷基鏈長度的離子液體對細胞周期、凋亡和自噬的毒理學機制,結(jié)果表明:隨著離子液體處理濃度和烷基鏈長度的增加,細胞周期阻滯、凋亡和自噬現(xiàn)象也隨之增加。說明在離子液體的作用下,通過對周期的阻滯、凋亡和自噬對細胞產(chǎn)生增殖抑制或者造成細胞死亡。另外,也分析了離子液體對細胞內(nèi)ROS產(chǎn)率的影響,結(jié)果表明:隨著離子液體處理濃度和烷基鏈長度的增加,ROS的產(chǎn)率顯著增加。說明細胞的周期阻滯、凋亡和自噬是在ROS的介導(dǎo)下發(fā)生的。通過對細胞超微結(jié)構(gòu)和細胞骨架結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)線粒體和細胞膜對離子液體的響應(yīng)最為明顯。隨著離子液體處理濃度和烷基鏈長度的增加,線粒體膜電位降低、自噬增加,細胞膜的結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞,細胞骨架微絲斷裂。這一結(jié)果表明離子液體與細胞相互作用,引起細胞膜的通透性增加,細胞膜通透性孔道的高水平開放,使得膜電位迅速下降。進而誘導(dǎo)細胞內(nèi)GSH的下降和ROS的增加,最終導(dǎo)致細胞凋亡和自噬。膜通透性的改變還會影響線粒體基質(zhì)的滲透壓,引起線粒體的腫脹及破裂,影響細胞能量代謝機制的運行。最后,從DNA角度進行分析發(fā)現(xiàn)隨著離子液體處理濃度和烷基鏈長度的增加,細胞核的完整性遭到破壞,細胞核碎片化現(xiàn)象嚴重,細胞周期發(fā)生阻滯。說明離子液體與細胞相互作用時,會引起DNA分子的損傷,進而影響細胞增殖。研究表明,基于光譜信息的離子液體毒性作用機制與細胞毒理學方法相互印證,且光譜手段還具有簡單、快速和樣品無損的特點,因此傅里葉變換紅外光譜分析在生物毒性測試研究中的應(yīng)用具有廣闊的前景。
【學位單位】：中國科學院大學(中國科學院廣州地球化學研究所)
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：X171.5
【部分圖文】：

的生物樣品分析方法，能夠提供獨特的、非標記性的分子組成信息，已然成為生物分子結(jié)構(gòu)研究的重要方法之一，被廣泛應(yīng)用于生命科學等各個領(lǐng)域。紅外光譜的工作原理如圖1.1所示，從光源發(fā)出的一束紅外光經(jīng)邁克爾遜干涉儀形成干涉光，到達檢測器再經(jīng)傅里葉變換對光譜信號處理，最后得到該樣品的紅外吸收峰。生物大分子產(chǎn)生紅外吸收的主要區(qū)域在3050-2800 cm-1和1800-900 cm-1這兩個波段，前者被稱為CH振動區(qū)，后者被稱為生化指紋區(qū)。CH振動區(qū)主要反映的是CH鍵的伸縮振動，與脂質(zhì)烷基鏈結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，主要包括=C-H伸縮振動，CH2和CH3的對稱和反對稱伸縮振動。生化指紋區(qū)主要反映的是生物大分子基本振動模式（Bakeretal.,2014），包括與脂質(zhì)相關(guān)的C=O（1740cm-1）、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相關(guān)的酰胺I（1650 cm-1）、酰胺II（1540 cm-1）、酰胺III（1300cm-1）、與游離氨基酸相關(guān)的COO-（1400cm-1）、與核酸結(jié)構(gòu)相關(guān)的PO2-的對稱（1080cm-1）和反對稱伸縮振動（1250cm-1）以及與碳水化合物相關(guān)的C-OH（1030cm-1）的振動（Movasaghi et al.

光譜數(shù)據(jù)一般采集 4000-400 cm-1范圍內(nèi)的振動信息。對生物行分析的數(shù)據(jù)包括與 CH 伸縮振動相關(guān)的 3050-2800cm-1和與的 1800-900 cm-1的光譜信息。對于生物樣本而言，其主要的、蛋白質(zhì)、核酸和糖類等。通過對上述生物分子的光譜信息解譜信息相關(guān)的生物大分子在結(jié)構(gòu)與功能上的變化情況。與脂質(zhì)收主要包括烷基鏈結(jié)構(gòu)（CH2和 CH3）、羰基及磷酸基團的振動吸收峰的分析可以得出與細胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)及膜脂過氧化程度的子相關(guān)的振動信息主要包括酰胺 I，酰胺 II，游離氨基酸殘基的振動信息。通過對酰胺I結(jié)構(gòu)的分析可以得到蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)酸的分析可以得到細胞內(nèi)氨基酸側(cè)鏈信息及蛋白質(zhì)翻譯后修核酸振動信息相關(guān)的吸收峰的分析可以得到與 DNA 二級結(jié)構(gòu)

圖 1.3 細胞及脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和 DNA 的紅外光譜圖Figure 1.3 The IR spectra of cell, lipid, protein and DNA3 紅外光譜在毒理學研究中的應(yīng)用3.1 FTIR 的在生物大分子研究中的應(yīng)用生物樣本的紅外光譜是由細胞內(nèi)生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和糖類貢獻。盡管各生物分子相當復(fù)雜，但其均具有獨特的特征，而且在光譜波段能很好區(qū)分（Martinetal.,2010）。如果將一個細胞看作是各生物大分子的一個混物，那么每一個細胞都將具有一個獨特的紅外吸收形式，呈現(xiàn)出一個獨特的光信息。當細胞受到環(huán)境脅迫，或者發(fā)生病變的時候，胞內(nèi)相應(yīng)的大分子在組成結(jié)構(gòu)上則會出現(xiàn)一定程度的變化。當這種變化通過光譜的形式被采集時，則會過紅外譜圖展現(xiàn)出來（Trevisan et al., 2012)。深入了解生物樣本的紅外光譜，

本文編號：2814991