近年來(lái),環(huán)境污染問(wèn)題已成為全球三大危機(jī)之一。各種污染物的大量排放給我們的生存環(huán)境產(chǎn)生了巨大影響,而目前對(duì)大量污染物的分布情況尤其是其毒性仍不清楚,無(wú)法有效評(píng)價(jià)污染物對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響。傳統(tǒng)的生物毒性測(cè)試方法是基于單一毒性終點(diǎn)(致死、抑制生長(zhǎng)等)對(duì)污染物的環(huán)境效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。而單指標(biāo)毒性測(cè)試方法很難準(zhǔn)確反映污染物對(duì)環(huán)境的全部影響。因此,發(fā)展多水平和多指標(biāo)的毒性測(cè)試方法對(duì)明確污染物毒性效應(yīng),評(píng)估化學(xué)品的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。本文針對(duì)目前常規(guī)生物毒性測(cè)試存在的問(wèn)題,建立了基于傅里葉變換紅外光譜的生物毒性測(cè)試方法。通過(guò)對(duì)樣品固定方式和儀器測(cè)量方法等的優(yōu)化,與傳統(tǒng)毒性測(cè)試方法進(jìn)行比較,論證了運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜進(jìn)行生物毒性測(cè)試的可行性。并進(jìn)一步從生物大分子水平入手,運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜,并結(jié)合細(xì)胞毒理學(xué)研究方法,對(duì)離子液體毒性效應(yīng)及作用機(jī)制進(jìn)行了深入分析。所取得的主要進(jìn)展包括:(1)優(yōu)化了傅里葉變換紅外光譜生物毒性試驗(yàn)的前處理方法和分析測(cè)試方法。本文選取三種常用的生物樣品固定液(70%乙醇、卡洛氏溶液、10%福爾馬林溶液),對(duì)紅外光譜生物毒性測(cè)試的前處理方法進(jìn)行比較,結(jié)果表明:卡洛氏溶液對(duì)生物分子的影響最為顯著,70%乙醇固定方法會(huì)溶解細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)物質(zhì)從而影響對(duì)脂質(zhì)分子的研究,而10%中性福爾馬林溶液對(duì)樣本進(jìn)行固定后,在生物大分子水平上的變化情況最小。通過(guò)比較測(cè)量模式和調(diào)試生物樣品紅外光譜測(cè)量參數(shù)發(fā)現(xiàn),當(dāng)設(shè)置分辨率為8 cm~(-1),掃描次數(shù)為64,以透射模式對(duì)浮萍樣品進(jìn)行紅外光譜掃描可以獲得較為豐富和準(zhǔn)確的生物大分子信息。(2)在污染物毒性測(cè)試研究中,分析了有機(jī)助溶劑的使用對(duì)毒性效應(yīng)的影響。結(jié)果表明:乙醇和甲醇兩種有機(jī)溶劑,即使處理濃度很小,也會(huì)對(duì)浮萍和綠藻的生長(zhǎng)及生物大分子水平產(chǎn)生影響;丙酮在OECD建議濃度(0.01%v/v)下毒性效應(yīng)較小;相比于其他溶劑,DMSO在劑量低于0.1%v/v時(shí)對(duì)浮萍的影響較小。因此,在水生生物毒性測(cè)試研究中,甲醇和乙醇不宜作為有機(jī)助溶劑,而0.1%v/v濃度下的DMSO是較為合適的有機(jī)助溶劑。(3)以重金屬離子(Cu和Cd)和農(nóng)藥(阿特拉津和乙草胺)為目標(biāo)化合物的浮萍生物毒性測(cè)試中,通過(guò)對(duì)傅里葉變換紅外光譜毒性測(cè)試方法與傳統(tǒng)毒性測(cè)試方法進(jìn)行對(duì)比研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),基于浮萍的傅里葉變換紅外光譜的生物毒性測(cè)試方法具有較高的額靈敏度,同時(shí)能獲得受試生物在外界刺激下機(jī)體內(nèi)生物大分子的變化信息。通過(guò)綜合分析脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA和多糖等生物大分子的變化情況,能夠更加準(zhǔn)確地檢測(cè)和評(píng)估污染物的毒性效應(yīng)。此外,金屬和農(nóng)藥的聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn):重金屬離子和農(nóng)藥由于各自作用方式的不同,對(duì)受試生物的聯(lián)合毒性效應(yīng)也各不相同。在環(huán)境樣品的生物毒性測(cè)試研究中,由于不同樣品中污染物成分和濃度不同,對(duì)受試生物的影響不相同,與受試生物相互作用時(shí)引起生物體內(nèi)大分子的變化也不相同,根據(jù)生物大分子的變化信息可以推測(cè)引起受試生物毒性效應(yīng)的化合物作用方法,進(jìn)而為環(huán)境樣品的生物毒性測(cè)試提供方向。(4)通過(guò)傅里葉變換紅外光譜對(duì)咪唑類離子液體的毒性進(jìn)行了研究。以不同烷基鏈長(zhǎng)度的咪唑氯鹽為研究對(duì)象,大腸桿菌、羊角月牙藻和Hela細(xì)胞作為受試生物,分析了離子液體在不同處理濃度和不同烷基鏈長(zhǎng)度下對(duì)受試生物的毒性效應(yīng)差異和變化規(guī)律。另外,基于不同處理濃度和烷基鏈長(zhǎng)度下受試生物細(xì)胞內(nèi)生物大分子的變化情況以及對(duì)生物大分子(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA)的光譜信息分析探討了其可能的毒性作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)受試生物與離子液體相互作用時(shí),主要通過(guò)誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生活性氧,通過(guò)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜產(chǎn)生氧化性損傷,從而影響細(xì)胞的流動(dòng)性和通透性;ROS通過(guò)與細(xì)胞膜蛋白、功能性蛋白及酶蛋白等相互作用,可以氧化性修飾蛋白質(zhì)上的氨基酸側(cè)鏈殘基以及造成肽鍵斷裂,主要是針對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、氨基酸殘基及蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平等的影響;ROS通過(guò)與DNA分子相互作用,對(duì)DNA分子的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。通過(guò)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞器及生物大分子產(chǎn)生氧化性損傷,最終導(dǎo)致受試生物的增殖抑制或者死亡。(5)研究了不同濃度和烷基鏈長(zhǎng)度的離子液體對(duì)細(xì)胞周期、凋亡和自噬的毒理學(xué)機(jī)制,結(jié)果表明:隨著離子液體處理濃度和烷基鏈長(zhǎng)度的增加,細(xì)胞周期阻滯、凋亡和自噬現(xiàn)象也隨之增加。說(shuō)明在離子液體的作用下,通過(guò)對(duì)周期的阻滯、凋亡和自噬對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制或者造成細(xì)胞死亡。另外,也分析了離子液體對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)率的影響,結(jié)果表明:隨著離子液體處理濃度和烷基鏈長(zhǎng)度的增加,ROS的產(chǎn)率顯著增加。說(shuō)明細(xì)胞的周期阻滯、凋亡和自噬是在ROS的介導(dǎo)下發(fā)生的。通過(guò)對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)線粒體和細(xì)胞膜對(duì)離子液體的響應(yīng)最為明顯。隨著離子液體處理濃度和烷基鏈長(zhǎng)度的增加,線粒體膜電位降低、自噬增加,細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞,細(xì)胞骨架微絲斷裂。這一結(jié)果表明離子液體與細(xì)胞相互作用,引起細(xì)胞膜的通透性增加,細(xì)胞膜通透性孔道的高水平開(kāi)放,使得膜電位迅速下降。進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)GSH的下降和ROS的增加,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和自噬。膜通透性的改變還會(huì)影響線粒體基質(zhì)的滲透壓,引起線粒體的腫脹及破裂,影響細(xì)胞能量代謝機(jī)制的運(yùn)行。最后,從DNA角度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)隨著離子液體處理濃度和烷基鏈長(zhǎng)度的增加,細(xì)胞核的完整性遭到破壞,細(xì)胞核碎片化現(xiàn)象嚴(yán)重,細(xì)胞周期發(fā)生阻滯。說(shuō)明離子液體與細(xì)胞相互作用時(shí),會(huì)引起DNA分子的損傷,進(jìn)而影響細(xì)胞增殖。研究表明,基于光譜信息的離子液體毒性作用機(jī)制與細(xì)胞毒理學(xué)方法相互印證,且光譜手段還具有簡(jiǎn)單、快速和樣品無(wú)損的特點(diǎn),因此傅里葉變換紅外光譜分析在生物毒性測(cè)試研究中的應(yīng)用具有廣闊的前景。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：X171.5
【部分圖文】：

的生物樣品分析方法，能夠提供獨(dú)特的、非標(biāo)記性的分子組成信息，已然成為生物分子結(jié)構(gòu)研究的重要方法之一，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。紅外光譜的工作原理如圖1.1所示，從光源發(fā)出的一束紅外光經(jīng)邁克爾遜干涉儀形成干涉光，到達(dá)檢測(cè)器再經(jīng)傅里葉變換對(duì)光譜信號(hào)處理，最后得到該樣品的紅外吸收峰。生物大分子產(chǎn)生紅外吸收的主要區(qū)域在3050-2800 cm-1和1800-900 cm-1這兩個(gè)波段，前者被稱為CH振動(dòng)區(qū)，后者被稱為生化指紋區(qū)。CH振動(dòng)區(qū)主要反映的是CH鍵的伸縮振動(dòng)，與脂質(zhì)烷基鏈結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，主要包括=C-H伸縮振動(dòng)，CH2和CH3的對(duì)稱和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)。生化指紋區(qū)主要反映的是生物大分子基本振動(dòng)模式（Bakeretal.,2014），包括與脂質(zhì)相關(guān)的C=O（1740cm-1）、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)的酰胺I（1650 cm-1）、酰胺II（1540 cm-1）、酰胺III（1300cm-1）、與游離氨基酸相關(guān)的COO-（1400cm-1）、與核酸結(jié)構(gòu)相關(guān)的PO2-的對(duì)稱（1080cm-1）和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)（1250cm-1）以及與碳水化合物相關(guān)的C-OH（1030cm-1）的振動(dòng)（Movasaghi et al.

光譜數(shù)據(jù)一般采集 4000-400 cm-1范圍內(nèi)的振動(dòng)信息。對(duì)生物行分析的數(shù)據(jù)包括與 CH 伸縮振動(dòng)相關(guān)的 3050-2800cm-1和與的 1800-900 cm-1的光譜信息。對(duì)于生物樣本而言，其主要的、蛋白質(zhì)、核酸和糖類等。通過(guò)對(duì)上述生物分子的光譜信息解譜信息相關(guān)的生物大分子在結(jié)構(gòu)與功能上的變化情況。與脂質(zhì)收主要包括烷基鏈結(jié)構(gòu)（CH2和 CH3）、羰基及磷酸基團(tuán)的振動(dòng)吸收峰的分析可以得出與細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)及膜脂過(guò)氧化程度的子相關(guān)的振動(dòng)信息主要包括酰胺 I，酰胺 II，游離氨基酸殘基的振動(dòng)信息。通過(guò)對(duì)酰胺I結(jié)構(gòu)的分析可以得到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)酸的分析可以得到細(xì)胞內(nèi)氨基酸側(cè)鏈信息及蛋白質(zhì)翻譯后修核酸振動(dòng)信息相關(guān)的吸收峰的分析可以得到與 DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖 1.3 細(xì)胞及脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和 DNA 的紅外光譜圖Figure 1.3 The IR spectra of cell, lipid, protein and DNA3 紅外光譜在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用3.1 FTIR 的在生物大分子研究中的應(yīng)用生物樣本的紅外光譜是由細(xì)胞內(nèi)生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和糖類貢獻(xiàn)。盡管各生物分子相當(dāng)復(fù)雜，但其均具有獨(dú)特的特征，而且在光譜波段能很好區(qū)分（Martinetal.,2010）。如果將一個(gè)細(xì)胞看作是各生物大分子的一個(gè)混物，那么每一個(gè)細(xì)胞都將具有一個(gè)獨(dú)特的紅外吸收形式，呈現(xiàn)出一個(gè)獨(dú)特的光信息。當(dāng)細(xì)胞受到環(huán)境脅迫，或者發(fā)生病變的時(shí)候，胞內(nèi)相應(yīng)的大分子在組成結(jié)構(gòu)上則會(huì)出現(xiàn)一定程度的變化。當(dāng)這種變化通過(guò)光譜的形式被采集時(shí)，則會(huì)過(guò)紅外譜圖展現(xiàn)出來(lái)（Trevisan et al., 2012)。深入了解生物樣本的紅外光譜，

本文編號(hào)：2814991