發(fā)布時間：2020-09-04 20:11

　　 工業(yè)發(fā)展的大爆發(fā),往往伴隨著環(huán)境嚴重污染的沉重代價。隨著世界工業(yè)尤其是采礦業(yè)、冶煉業(yè)、印染業(yè)、電鍍業(yè)等的迅速發(fā)展以及農藥、化肥的大量使用,嚴重地污染了土壤、水質和空氣,其中土壤中的重金屬(Hg、Cd、As、Cu和Al)污染尤為嚴重。汞是一種極毒的重金屬元素,其毒性位于各金屬之首。汞是植物的非必需元素,對植物生長和發(fā)育毒性顯著,當植物體中的汞積累到一定程度后,會通過不同的途徑干擾和破壞細胞正常的代謝過程,導致植物生長異常直至死亡；同時汞通過植物進入食物鏈富集后會危害動物及人體健康。植物在漫長的進化過程中,形成了一系列潛在的機制,間接或直接的參與重金屬毒害的解除或適應于重金屬脅迫的環(huán)境,涉及形態(tài)、生理、發(fā)育、分子細胞等各個層次的復雜的生物學過程。鹽生植物海馬齒(Sesuvium portulacastrun)屬番杏科(Aizoaceae)海馬齒屬(Sesuvium),草本或亞灌木植物,分布于熱帶和亞熱帶海岸的沙灘上。我們實驗室前期研究發(fā)現海馬齒不僅能適應高濃度的鹽環(huán)境而且能吸附積累大量的Hg2+。在本研究中,從蛋白質組學、基因差異,結合相應的植物形態(tài)、結構和生理變化對海馬齒耐汞性機理進行了初步的研究；同時通過分子生物學方法從海馬齒植物中分離了三個與耐汞相關的新基因,并對它們在微生物和擬南芥植物中進行了功能分析,結果如下： 1、利用雙向電泳技術,獲得無Hg2+脅迫下和Hg2+下的海馬齒總蛋白點1019個,上調或下調2倍以上的蛋白點有116個,汞脅迫下新出現的蛋白點99個。 2、本研究挑選上調或下調2倍以上,或新的蛋白點46個,其中上調3倍以上為35個,下調2倍以上為5個,在Hg2+脅迫下新出現的蛋白點6個進行一級和二級質譜分析。通過質譜分析,其中19個蛋白點被鑒定出來,這些蛋白點按功能分類,可分為6類：(Ⅰ)光合作用相關蛋白,占42%；(Ⅱ)能量代謝蛋白,占26%；(Ⅲ)氨基酸代謝蛋白,占11%；(Ⅳ)核苷酸代謝蛋白,占11%；(Ⅴ)響應逆境脅迫和防御相關蛋白,占5%；(Ⅵ)未知功能和假想蛋白,占5%。 3、結合蛋白質組學分析的結果,利用分子生物學手段,對海馬齒中4個基因進行了全長cDNA序列克隆,得到了其中3個基因的全長序列并登陸,它們分別為金屬硫蛋白基因(SpMT),GenBank登錄號：JN185440；谷氨酰胺合成酶基因(SpGS)GenBank登錄號：JQ425085；葉綠體ATP酶α亞基基因(SpF-ATP-α)GenBank登錄號：JN192444;及一個基因的部分序列,葉綠體ATP合酶β亞基基因(F-ATP-β),并對三個全長基因進行了生物信息學分析。 4、利用實時熒光定量PCR技術,分析了三個全長基因組織特異性表達情況及對汞離子脅迫的響應。結果表明：三個基因均主要在葉片中表達,葉中的表達量明顯高于根與莖中的表達量。在含汞的環(huán)境下,SpMT與SpF-ATP-α基因明顯響應Hg2+脅迫,其表達量隨Hg2+的增高和脅迫時間的增長而增高。SpGS基因在低濃度汞處理時其表達量升高,高濃度Hg2+脅迫下SpGS基因表達被抑制,但是隨著脅迫時間的增長,無論是在高濃度還是低濃度汞脅迫下SpGS基因表達量均有上升的趨勢。 5、構建了SpMT、SpGS、SpF-ATP-α三個基因的原核表達載體,并在大腸桿菌中進行了表達。根據金屬硫蛋白的特殊性質,構建了三個含有不同分子伴侶的SpMT基因原核表達載體,分析了不同的分子伴侶對金屬硫蛋白基因在原核中表達的影響,發(fā)現帶SUMO分子伴侶的P-Cold-sumo載體最適合表達金屬硫蛋白。構建了帶SUMO分子伴侶的SpGS、SpF-ATP-α P-Cold-sumo載體,并分析了它們在微生物中的表達情況,結果表明SpGS、SpF-ATP-α基因均能成功表達。 6、SpMT、SpGS、SpF-ATP-α在大腸桿菌Ecoli Top10中表達,SpMT能明顯提高E.coliTop10的耐汞能力,而轉SpGS基因的EcoliTop10具有輕微的耐汞性,SpF-ATP-α則不能提高大腸桿菌Ecoli Top10的耐汞能力。 7、構建了SpMT基因植物表達載體pVKH-35s-SpMT并成功轉化模式植物擬南芥,耐汞性分析表明：SpMT基因能明顯提高擬南芥對汞的耐受性,植物表現為：在含有濃度為5μ mol/L及10μmol/L HgCl2的培養(yǎng)基中能正常生長,生物量、葉綠素含量、根的數目及長度明顯高于對照。 8、與GFP基因融合,構建了pCAMBIA-1304-35s-SpMT植物表達載體,并將其在洋蔥表皮細胞中表達。亞細胞定位表明：SpMT基因主要為核表達,膜上有微量的表達。 9、測定了不同濃度和不同時間汞脅迫下,海馬齒谷氨酰胺合成酶與葉綠體ATP合酶活性變化的情況,結果表明,ATP合酶活性在汞脅迫環(huán)境下隨著時間的增長和濃度的增高而增高,海馬齒谷氨酰胺合成酶活性在低濃度汞脅迫環(huán)境下隨著時間的增長和濃度的增高而增高,高濃度汞脅迫環(huán)境下,其活性出現先被抑制,一段時間后再升高的趨勢。 10、通過透射電鏡觀察發(fā)現,Hg2+對海馬齒葉片的傷害主要表現為：1)細胞膜不斷向胞內形成膜突起再形成空泡；2)隨著Hg2+濃度不斷升高,其葉綠體數目不斷減少,體積變大,形狀由橢圓型變成長型；3)類囊體基粒片層變得模糊不清；4)線粒體數目由少變多,形狀由棒狀變成圓形及橢圓型,線粒體雙層膜結構與嵴變得模糊不清；5)細胞核核仁由一個變成多個,最后消失。 11、通過掃描電鏡觀察發(fā)現：1)在Hg2+脅迫下,海馬齒根的表面結構變得散亂,而無Hg2+的海馬齒根的表面結構緊湊有序;2)Hg2+迫下葉片表面的氣孔數目較多,大多數呈閉合狀態(tài),保衛(wèi)細胞大而飽滿成半圓形,冷凍干燥后葉片表面無皺褶；而非汞脅迫下,葉片表面的氣孔數目較少,保持開放狀態(tài),保衛(wèi)細胞為長條形,冷凍干燥后葉片皺褶的厲害；3)在非Hg2+下海馬齒莖橫切面的導管成規(guī)則狀排列,導管壁較薄,而在Hg2+脅迫下導管變大、成不規(guī)則狀排列,導管壁厚,壁上多了很多內含物。
【學位單位】：海南大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2012
【中圖分類】：X173
【部分圖文】：

(引用 BarkayT 等 2003)圖1自然環(huán)境中的錄循環(huán)Fig. 1 The mercury cycle in natural environment

世界上最主要的汞排放屬商年的汞排觸且(陶年)

匕.操獲升隨洲田

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本文編號：2812530