鎘是許多工業(yè)廣泛使用的高毒重金屬環(huán)境污染物,鎘對(duì)人和其他哺乳動(dòng)物的肝、腎、肺、胰腺、睪丸、胎盤和骨等許多器官和組織都有毒性。鎘所致機(jī)體損傷的機(jī)制十分復(fù)雜且尚不明確,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證明鎘可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激或凋亡/死亡,且凋亡與線粒體、細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)態(tài)平衡、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活等有關(guān)。對(duì)嚙齒動(dòng)物研究證明,鎘最初主要累積在肝臟,所以暴露毒性劑量的鎘首先引起肝臟受損。本論文以大鼠肝細(xì)胞為模型,采用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法研究鎘致體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞的毒性作用及機(jī)理。 1.鎘對(duì)大鼠肝細(xì)胞毒性損傷的研究 采用兩步灌流法獲得大鼠肝細(xì)胞,經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng),換以含2.5、5、10μmol/L醋酸鎘的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12h和24h,測(cè)定鎘對(duì)細(xì)胞存活率、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH、ALT和AST的活性,以及鎘對(duì)細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)的影響。 結(jié)果表明,隨著鎘濃度的增大,肝細(xì)胞的存活率逐漸降低,12h和24h時(shí)各劑量染鎘組細(xì)胞存活率均極顯著低于對(duì)照組(P0.01)；隨著鎘劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞急劇變形,壞死細(xì)胞增多,線粒體腫脹變形,線粒體嵴模糊,內(nèi)容物皺縮空泡化或最終崩解。LDH、AST和ALT釋放量隨劑量增加而增加,部分劑量組LDH、AST和ALT活性與對(duì)照組相比差異顯著或極顯著(P0.05或P0.01)。 2.鎘對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡及氧化損傷的研究 醋酸鎘處理肝細(xì)胞,測(cè)定鎘對(duì)細(xì)胞凋亡率、氧化應(yīng)激指標(biāo)、活性氧(ROS)水平及線粒體膜電位(△Ψm)的變化。 結(jié)果表明,12h時(shí)細(xì)胞內(nèi)GSH含量隨鎘劑量增高而降低,部分劑量組極顯著(P0.01)低于對(duì)照組,24h時(shí)隨劑量增高而升高,5和10μmol/L劑量組顯著或極顯著(P0.01)高于對(duì)照組,GSH-PX的活性變化與之相反；隨著鎘劑量的增大和作用時(shí)間延長(zhǎng),SOD和CAT活性、MDA含量均升高,部分劑量與對(duì)照組相比差異顯著或極顯著(P0.05或P0.01)；而GST和GR活性降低,但與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P0.05)；細(xì)胞凋亡率升高,細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加和△Ψm降低,部分劑量組與對(duì)照組差異顯著或極顯著(P0.05或P0.01)；表明鎘可致肝細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,且通過(guò)線粒體途徑引起細(xì)胞凋亡。 3.N-乙酰半胱氨酸對(duì)鎘致肝細(xì)胞損傷的影響 對(duì)肝細(xì)胞染毒的同時(shí)添加NAC,通過(guò)測(cè)定肝細(xì)胞的存活率、細(xì)胞形態(tài)和凋亡、△甲m和ROS的變化,觀察NAC對(duì)鎘致大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。 結(jié)果表明,NAC可顯著或極顯著提高鎘處理細(xì)胞存活率(P0.05或P0.01),呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,NAC可使鎘處理組皺縮和壞死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞明顯減少,顯著或極顯著降低鎘處理細(xì)胞ROS生成和阻止△Ψm的降低(P0.05或P0.01)。表明NAC可有效保護(hù)鎘致大鼠肝細(xì)胞的毒性損傷。 4.鎘致大鼠肝細(xì)胞凋亡的非caspase途徑 用醋酸鎘處理肝細(xì)胞,觀察caspase-3含量變化以及caspases廣譜抑制劑Z-VAD-fink對(duì)鎘致細(xì)胞存活率、形態(tài)和凋亡變化的影響。 結(jié)果表明,鎘暴露的不同時(shí)間,肝細(xì)胞caspase-3活性無(wú)明顯變化,與對(duì)照組差異不顯著(P0.05); Z-VAD-fmk對(duì)鎘所致的細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞凋亡無(wú)顯著影響。表明caspase途徑未參與鎘致大鼠肝細(xì)胞的凋亡過(guò)程。 5.鈣離子超載在鎘致大鼠肝細(xì)胞凋亡中的作用 通過(guò)不同濃度醋酸鎘處理肝細(xì)胞,不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,以及鈣離子抑制劑Bapta-AM對(duì)鎘致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)ROS和△Ψm變化的影響。 結(jié)果表明,鎘暴露1.5h時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平極顯著升高(P0.01),但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平迅速下降,并接近對(duì)照組水平。而Bapta-AM可以顯著降低鎘引起的鈣離子水平升高,并顯著提高鎘處理細(xì)胞的存活率(P0.05)。另外Bapta-AM可使鎘處理細(xì)胞形態(tài)趨于完整、并使變形細(xì)胞和凋亡細(xì)胞減少,顯著或極顯著減少ROS產(chǎn)生和抑制△Ψm降低(P0.05或P0.01)。說(shuō)明鎘可致肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高,鈣離子抑制劑Bapta-AM能有效降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平及細(xì)胞損傷,提示鈣離子超載在鎘致肝細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。 6.鎘致大鼠肝細(xì)胞凋亡的MAPK途徑 在10μmol/L醋酸鎘處理肝細(xì)胞的同時(shí),用p38抑制劑SB202190、JNK抑制劑SP600125、ERK抑制劑U0126單獨(dú)或聯(lián)合作用于肝細(xì)胞,測(cè)定細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡率、△甲m和磷酸化p38蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果表明,SB202190可以顯著或極顯著提高鎘處理組細(xì)胞的存活率,減少變形細(xì)胞和凋亡細(xì)胞數(shù)量(P0.05或P0.01),但SP600125和U0126作用相反。鎘可極顯著提高肝細(xì)胞磷酸化p38的表達(dá)量(P0.01),而SB202190能極顯著降低其表達(dá)(P0.01)；SB202190還可極顯著升高鎘引起的△甲m降低(P0.01)。說(shuō)明鎘暴露使肝細(xì)胞產(chǎn)生的ROS引起p38 MAPK途徑激活,并通過(guò)損傷線粒體引起細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：X174
【部分圖文】：

剛分離的大鼠肝細(xì)胞Fig.l-1Freshisolatedrat圖1-2臺(tái)盼蘭染色的肝細(xì)胞圖1一培養(yǎng)24h的大鼠肝細(xì)胞Fig.l

HePatocytestreatedwith0-10娜 oljLCdfor12hor24h2.2錫對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活性、MDA含量的影響如表2一2和圖2一5硯一7所示。12h時(shí)，隨著福濃度的增大，SOD和CAT活性、MDA含量均升高，福的濃度為5娜。譏和10腳。譏時(shí)，soD的活性與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01);福的濃度為10林mo比時(shí)，CAT的活性和MDA的含量與對(duì)照組相比差異極顯著或顯著(尸<0.01或尸<0.05)。24h時(shí)，隨著福濃度的增大，SOD和CAT活性均升高，鍋的濃度為10林mol幾時(shí)，SOD活性和MDA含量與對(duì)照組相比差異分別極顯著或顯著(P<0.01或尸<0.05);鍋的濃度高于5娜。譏時(shí)

02.55以(卿。比)圖2一4福對(duì)肝細(xì)胞GR活性的影響o一10卿ol/L錫作用肝細(xì)胞12h或24hFig.2一 4EffectofCdontheGRactivityinhePatoeytes HePatocytestreatedwith0-10娜 oljLCdfor12hor24h2.2錫對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活性、MDA含量的影響如表2一2和圖2一5硯一7所示。12h時(shí)，隨著福濃度的增大，SOD和CAT活性、MDA含量均升高，福的濃度為5娜。譏和10腳。譏時(shí)，soD的活性與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01);福的濃度為10林mo比時(shí)，CAT的活性和MDA的含量與對(duì)照組相比差異極顯著或顯著(尸<0.01或尸<0.05)。24h時(shí)，隨著福濃度的增大，SOD和CAT活性均升高，鍋的濃度為10林mol幾時(shí)，SOD活性和MDA含量與對(duì)照組相比差異分別極顯著或顯著(P<0.01或尸<0.05);鍋的濃度高于5娜。譏時(shí)

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2812232