隨著環(huán)境污染問題的日益突出,人們對污染物檢測和監(jiān)管提出了更高的要求,發(fā)展新的、靈敏、可靠的檢測方法具有十分重要的意義。本論文主要從降低檢測背景和增強檢測信號兩個方面對提高檢測方法的靈敏度進行了研究,基于不同的新型材料構(gòu)建了一系列新的生物傳感方法,并將其應(yīng)用于環(huán)境污染物、環(huán)境微生物等檢測。本論文包括的主要內(nèi)容如下:(1)以氧化石墨烯為反應(yīng)平臺,提出了一種基于分子信標向G-四鏈體構(gòu)型轉(zhuǎn)換,繼而引發(fā)核酸雜交連鎖反應(yīng)的高靈敏Pb~(2+)檢測方法。作者設(shè)計了兩段分子信標探針H1和H2,H1的一端為富含鳥嘌呤(G)的序列,并且“莖”部分有一個堿基錯配。當(dāng)不存在Pb~(2+)時,由于石墨烯對探針單鏈部分具有強烈的吸附作用,H1和H2吸附在石墨烯表面。當(dāng)Pb~(2+)存在時,H1分子信標被打開,富含G堿基的一端與Pb~(2+)形成G-四鏈體結(jié)構(gòu),另一端暴露出來的單鏈序列啟動核酸雜交連鎖反應(yīng),不斷有分子信標被打開,最終形成超長的雙鏈結(jié)構(gòu)。因為石墨烯對雙鏈DNA的吸附作用較小,雙鏈探針從石墨烯表面脫離,熒光得到恢復(fù)。由于石墨烯超強的熒光猝滅效率以及核酸雜交連鎖反應(yīng)的放大作用,該方法實現(xiàn)了對Pb~(2+)的高靈敏檢測,最低檢出限為0.61 nM。另外,該方法操作簡單,選擇性好,靈敏度高,并且適用于實際水樣中Pb~(2+)的檢測。(第2章)(2)基于磁性Fe_3O_4和核酸雜交連鎖反應(yīng),通過構(gòu)建一種超串聯(lián)探針信號放大模式,實現(xiàn)了對Hg~(2+)的高靈敏檢測。該方法中應(yīng)用了三段核酸探針:H1和H2的一端是富含胸腺嘧啶(T)的序列,H2與H3部分堿基互補配對。當(dāng)待測體系中含有Hg~(2+)時,H1和H2之間通過T-Hg~(2+)-T錯配形成雙鏈,進而引發(fā)核酸雜交連鎖反應(yīng),H2和H3的分子信標結(jié)構(gòu)不斷被打開,形成超串聯(lián)核酸探針,從而達到放大熒光信號的目的。該方法的檢出限為0.36 nM,能夠滿足世界衛(wèi)生組織(WHO)對飲用水質(zhì)監(jiān)測標準的要求(10 nM)。在本方法中,磁性Fe_3O_4作為反應(yīng)平臺和分離介質(zhì),將檢測目標和信號探針從檢測介質(zhì)中分離出來,有效地降低了其他離子的干擾,使得該方法具有良好的選擇性,并且能成功地應(yīng)用到實際樣品的檢測中。(第3章)(3)利用磁性石墨烯對ssDNA的選擇性吸附能力和磁性分離能力,提出了一種先捕獲、富集,后檢測的Hg~(2+)定量測定方法。該檢測體系包含H1和H2兩段核酸探針。探針H1具有兩個功能,富含T堿基的序列可以捕獲Hg~(2+),其他序列可以通過吸附將整個探針固定在磁性石墨烯表面。當(dāng)溶液中的Hg~(2+)被H1探針捕獲到磁性石墨烯表面,并且通過磁性分離和富集之后,加入釋放序列H2,使得H1和H2形成完整的雙鏈結(jié)構(gòu),進而從石墨烯表面脫離,釋放出熒光。在最佳實驗條件下,經(jīng)過5倍富集,該方法的最低檢出限為1.54 nM。該方法檢測范圍寬,靈敏度高,操作簡單,能夠較好地應(yīng)用于環(huán)境水樣的檢測。(第4章)(4)提出了一種基于納米金和核酸雜交連鎖反應(yīng)的高靈敏比色方法用于檢測水體中的Hg~(2+)。當(dāng)反應(yīng)體系中不含Hg~(2+)時,H1、H2的單鏈部分吸附在納米金表面,使金納米粒子在高濃度鹽溶液中穩(wěn)定存在;而當(dāng)Hg~(2+)存在時,H1的分子信標結(jié)構(gòu)能夠在Helper探針的輔助下被打開,繼而引發(fā)核酸雜交連鎖反應(yīng),使分子信標不斷被打開形成雙鏈結(jié)構(gòu)。由于失去單鏈的保護作用,金納米粒子在高濃度鹽溶液中發(fā)生團聚,顏色由紅色變?yōu)樗{色。該方法操作簡單,只需將幾種試劑混合檢測即可,并且具有高靈敏度,高選擇性的優(yōu)點,適用于實際水體中Hg~(2+)的檢測。(第5章)(5)基于非標記納米金粒子的泄漏過程,提出了一種熒光能量共振轉(zhuǎn)移法,實現(xiàn)了環(huán)境水體中鹽酸的選擇性定量檢測。納米金的最大吸收波長在520 nm左右,與熒光素的熒光發(fā)射波長一致,所以納米金通過熒光能量共振轉(zhuǎn)移能有效地猝滅熒光素的熒光。當(dāng)存在鹽酸時,納米金的數(shù)量和表面形態(tài)發(fā)生改變,引起納米金吸光度降低,進而導(dǎo)致熒光強度升高。通過測定熒光強度,可以十分靈敏地實現(xiàn)鹽酸濃度的檢測。實驗表明,該方法在30 min內(nèi)即可完成檢測,最低檢出限為0.6μM。由于金化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,其他離子的存在以及一般微小的環(huán)境變化對納米金的表面形態(tài)影響不大,所以該方法具有良好的選擇性。(第6章)(6)建立了一種基于銪配合物的時間分辨熒光傳感方法,實現(xiàn)了對水處理工藝中重要的功能菌——氨氧化細菌的定量檢測。銪配合物是一種長壽命發(fā)光材料,在時間分辨模式下可以有效降低生物基質(zhì)的背景熒光,提高檢測方法的靈敏度。根據(jù)氨氧化細菌特異性序列,設(shè)計得到了兩段功能探針:末端修飾氨基的捕獲探針與目標序列的一部分堿基互補,并且通過戊二醛的交聯(lián)作用可以固定在氨基硅烷化的普通玻璃片表面;標記銪配合物的信號探針與目標DNA的另外一段堿基互補。當(dāng)存在目標DNA時,捕獲探針和信號探針分別與目標DNA雜交,形成串聯(lián)結(jié)構(gòu),進而將信號探針固定在玻璃片表面。通過測定銪配合物的時間分辨熒光強度可以定量檢測目標DNA和氨氧化細菌的數(shù)量。該方法靈敏度高,對常見大腸桿菌、多粘芽孢桿菌以及維氏硝化桿菌等細菌具有優(yōu)異的選擇性,并且能成功應(yīng)用于實際污泥樣品的檢測。(第7章)(7)基于長壽命量子點和葡萄糖氧化酶,建立了一種靈敏的非標記方法檢測血清中的葡萄糖。葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下產(chǎn)生的過氧化氫對量子點具有猝滅作用,因此量子點可以用于葡萄糖的定量檢測。但是由于過氧化氫對量子點熒光的猝滅效率不高,所以基于該原理的檢測方法靈敏度較低。通過向該檢測體系中引入對苯二胺,設(shè)計了一種更靈敏的葡萄糖檢測方法。對苯二胺在過氧化氫的氧化作用下產(chǎn)生的復(fù)雜化合物對量子點的熒光具有更高的猝滅效率,從而提高了檢測方法的靈敏度。另外,以長壽命量子點為熒光指示劑,在時間分辨熒光模式下能有效去除生物基質(zhì)中的背景熒光,降低干擾,使該方法在應(yīng)用性實驗中取得了較好的效果。該方法不需要繁瑣的材料標記和酶固定,操作簡單,靈敏度高,并且具有優(yōu)異的選擇性,可以成功的應(yīng)用于血清中葡萄糖的檢測。(第8章)
【學(xué)位單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：X832
【部分圖文】：

圖 1.1 長壽命熒光材料降低檢測背景值的原理1.1 Schematic of background signal reduction using long-life time fluorescence m 稀土金屬配合物土元素包括 15 種鑭系元素以及另外的 Sc 和 Y 兩種元素。在稀土元結(jié)構(gòu)中，4f 層電子沒有充滿，因此能產(chǎn)生多種不同的電子能級。稀熒光強度很弱，難以滿足在分析中的應(yīng)用要求，但是當(dāng)與某些有機形成稀土金屬配合物時，配體與稀土離子之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，其熒高[40-42]。在此過程中，配體吸收能量轉(zhuǎn)移給稀土離子，因此吸收波，而發(fā)射波長由稀土離子的種類決定。然而，并非所有的稀土離子能發(fā)射很強的熒光，根據(jù)已有研究，Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+四種量子產(chǎn)率高，熒光強度強[43~45]。稀土配合物與普通的熒光染料相比勢：（1）熒光壽命長。稀土配合物的熒光通過三重能態(tài)能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)需要一定的延遲時間，所以稀土配合物的熒光壽命遠遠長于普通熒光合物為例，配體與 Eu3+之間的能量轉(zhuǎn)移如圖 1.2 所示。稀土配合物

圖 1.2 銪配合物的發(fā)光原理Figure 1.2 Emission mechanism of europium complex于上述優(yōu)點，基于稀土配合物的時間分辨熒光法已廣泛應(yīng)用于核酸命大分子以及金屬離子的檢測。早在 1975 年，Smith 就已經(jīng)提出“”的概念，合成了一種銪配合物，并進行了初步的應(yīng)用[46]。在 198i 等用銪配合物作為熒光標記物建立了一種檢測乙肝病毒的免疫分析時間分辨熒光來降低熒光背景值的思路，開啟了時間分辨熒光免疫[47]。Yuan 等用 BHHCT Eu3+做為標記物研究比較了競爭免疫和非實了競爭免疫可以提高檢測的靈敏度和精確度，此研究中建立的時疫方法比放射免疫法和酶聯(lián)免疫法靈敏度高 10～100 倍[48]。有研究子與配體之間能量轉(zhuǎn)移的發(fā)光原理，將配體和配合物中心離子分別探針上，建立了均相核酸雜交分析方法[49]。除了作為分析方法的標究將稀土配合物作為標記物應(yīng)用于抗體的篩選[50]。3 量子點

3. 量子點在生物傳感中的應(yīng)用量子點一般作為熒光標記物應(yīng)用在生物分析方法中，通過檢測生物分子識別過程中的熒光變化來實現(xiàn)靶標分子的檢測。這些方法一般通過三種途徑實現(xiàn)分子識別過程中熒光信號的響應(yīng)，一種是量子點與有機染料之間的熒光能量共振轉(zhuǎn)移，熒光能量共振轉(zhuǎn)移法是最常見的方法，在分子識別過程中量子點和有機染料的距離減小，量子點和有機染料之間就會發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移[75-77]。以三明治雜交模式為例，如圖 1.3（A）所示，檢測體系包含兩條 DNA 探針，一條標記在量子點表面，另外一條末端標記有機染料，如果目標 DNA 存在，則可以同時與連接量子點和有機染料的探針雜交，使量子點和熒光基團之間的距離減小，發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移。該方法的優(yōu)點是靈敏度高，并且目標序列無需標記，缺點是只適用于短鏈序列的檢測[78]。有研究者在以上反應(yīng)模式的基礎(chǔ)上，利用量子點吸收光譜寬、發(fā)射光譜窄等優(yōu)點建立了多通道的分析方法，通過兩種不同的熒光基團與量子點之間的熒光能量轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)兩種不同目標物的檢測[79]。同樣的，在分子信標的兩端標記量子點和熒光基團，也可以在分子信標構(gòu)型的轉(zhuǎn)變中實現(xiàn)熒光能量共振轉(zhuǎn)移的開關(guān)[80]。

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1 俞汝勤;沈國勵;吳海龍;蔣健暉;;納米生物傳感技術(shù)研究的某些新進展[J];化學(xué)傳感器;2005年02期

2 鞠q

本文編號：2810958