【摘要】：聚羥基脂肪酸酯（PHA）是微生物利用可再生資源如碳水化合物、脂肪酸等體內(nèi)合成的一類生物聚酯，它不僅具有與傳統(tǒng)化學合成高分子（如聚丙烯）相似的材料性質(zhì)，而且是環(huán)境友好型可降解材料。另外，PHA還具有生物相容性、壓電性、光學活性等特殊性質(zhì)，并且是人工骨等醫(yī)學材料的最佳原料之一。隨著石油資源的日益枯竭，PHA的研究開發(fā)引起了越來越多的重視。 相對于常溫微生物，嗜熱微生物在中溫發(fā)酵生產(chǎn)PHA具有許多優(yōu)良的性能，表現(xiàn)為：（1）中溫條件下底物溶解度提高，酶催化反應速率快，可以有效提高細菌的生長速度和PHA產(chǎn)率；（2）中溫條件下可以抑制雜菌的生成，保證嗜熱產(chǎn)PHA微生物成為優(yōu)勢菌種，使發(fā)酵合成PHA系統(tǒng)更易穩(wěn)定運行；（3）微生物發(fā)酵的自發(fā)產(chǎn)熱可以維持嗜熱微生物生長的適宜溫度，無需額外的冷卻與加熱；（4）對嗜熱微生物PHA合成相關酶及編碼基因的耐熱機制進行分析研究，可為PHA合成酶的定向進化提供理論參考，所分離的耐熱PHA合成酶可應用于PHA的體外合成。然而目前發(fā)現(xiàn)能在中溫條件下合成PHA的嗜熱微生物僅有幾種，且這些微生物的菌體濃度都較低，不具備工業(yè)化研發(fā)潛力。 本課題組從脫氮生物濾塔中篩選到一株產(chǎn)PHA的嗜熱螯臺球菌TAD1，這是該菌首次被報道具有產(chǎn)PHA的能力，但是該菌的PHA含量較低，只有56.3%。因此本論文采用尼羅紅瓊脂平板法對螯臺球菌進行篩選，獲得高效積累PHA的優(yōu)勢菌株TAD1S，利用熒光顯微鏡觀察PHA在細胞體內(nèi)的積累情況，通過氣相色譜、紅外衍射光譜和核磁共振掃描等分析方法，檢測螯臺球菌所積累PHA的結(jié)構(gòu)特征和材料特性，以及在細胞體內(nèi)的含量；考察TAD1S細胞生長與PHA積累之間的聯(lián)系，初步研究不同因素對TAD1S發(fā)酵產(chǎn)PHA的影響規(guī)律，探討不同碳源在TAD1S體內(nèi)的代謝途徑和PHA轉(zhuǎn)化效率；深入研究不同因素對TAD1S利用生物柴油副產(chǎn)物（甘油）發(fā)酵產(chǎn)PHA的影響規(guī)律，消除高濃度甘油對TAD1S生長的抑制，建立了基于甘油的發(fā)酵產(chǎn)PHA體系；采用5-l生物反應器研究發(fā)酵工藝對TAD1S發(fā)酵產(chǎn)PHA的特點，為擴大規(guī)模產(chǎn)PHA建立理論模型。 在20g/L葡萄糖、45℃、180r/min下，TAD1S培養(yǎng)36h后，其生物量和PHA含量分別為2.71g/L和73.6%。通過多種分析手段，確定能合成短鏈聚羥基脂肪酸酯（scl-PHA），其中絕大部分為聚（3-羥基丁酸）（PHB）（99%）。 TAD1S利用葡萄糖發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)PHB的積累與細胞生長同步進行，而無需嚴格的氮源限制。TAD1S在45-55℃范圍內(nèi)有好的PHB積累性能，即使溫度高達60℃，TAD1S仍然可生長并積累PHB，說明TAD1S體內(nèi)的PHB合成相關酶有好的熱穩(wěn)定性。隨著碳氮摩爾比的升高，TAD1S的PHB含量均逐漸增大，然而，即使在高濃度的氮源環(huán)境下（C/N=5），TAD1S仍可積累一定濃度的PHB（55.7%），這說明TAD1S有好的抗高氮源濃度特性�？傊琓AD1S利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)PHB的最適條件為：發(fā)酵時間28h，發(fā)酵溫度50℃，碳氮摩爾比30。此時生物量、PHB含量和PHB得率分別為4.50g/L、76.5%和3.44g/L。 另外，TAD1S還可利用大部分短鏈脂肪酸鈉鹽（C2-C6）來產(chǎn)PHB，說明TAD1S體內(nèi)的PHA合成途徑是scl-PHA合成途徑；TAD1S可以在中溫環(huán)境下直接利用淀粉進行生長，而無需水解預處理。通常絕大部分基于甘油產(chǎn)PHA的微生物都是常溫微生物，而TAD1S在中溫條件下可以利用甘油發(fā)酵產(chǎn)PHB，在最適條件下，TAD1S的生物量、PHB含量和PHB得率可達8.12g/L，80.8%和6.56g/L，此時底物轉(zhuǎn)化率和PHB時空產(chǎn)率分別為0.33和0.21g/L/h。 采用5-l生物反應器進行擴大培養(yǎng)研究，探討TAD1S利用甘油產(chǎn)PHB的規(guī)律。采用分段補料發(fā)酵方法，在發(fā)酵后期進行限氮控制，可有效提升PHB得率，減少下游分離純化工藝成本。發(fā)酵40h后得到最大PHB含量68.3%，此時生物量、PHB得率、底物轉(zhuǎn)化率和時空產(chǎn)率分別為25.4g/L、17.4g/L、0.26和0.434g/L/h，說明限氮控制可以有效提高TAD1S體內(nèi)的PHB含量。該中溫工藝與其它常溫工藝相比，培養(yǎng)時間減少，而底物轉(zhuǎn)化率和PHB時空產(chǎn)率卻顯著增大，展現(xiàn)優(yōu)越的發(fā)酵性能與應用前景。 另外，我們采用尼羅紅瓊脂平板法從TAD1S的來源（脫氮生物濾塔的生物膜）進行篩選，獲得一株生長良好且積累PHA的新菌株-K5。經(jīng)系列檢測分析，發(fā)現(xiàn)該菌合成的PHA主要也是PHB，說明K5體內(nèi)的PHA合成途徑也是scl-PHA合成途徑，該過程最適溫度和初始pH分別為45℃和7.0。 本研究初步闡明了TAD1S和K5在中溫條件下利用不同碳源發(fā)酵產(chǎn)PHA的特征與規(guī)律，為后續(xù)菌株改造，大規(guī)模擴大培養(yǎng)提供了理論依據(jù)。
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：TQ920.1;X172

【參考文獻】

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1 陳國強;;生物塑料-聚羥基脂肪酸酯PHA發(fā)展近況[J];新材料產(chǎn)業(yè);2009年02期

本文編號：2805257