【摘要】： 使用微生物來(lái)源的污染物降解相關(guān)基因改造植物，可以使植物獲得降解污染物的能力而用于環(huán)境治理，這是一種有效的清除污染物的方法。芳香族化合物是現(xiàn)在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的一類主要污染物。此類污染物具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定苯環(huán)結(jié)構(gòu)，難以降解。在此項(xiàng)研究中，我們利用鄰單胞桿菌來(lái)源的氯代鄰苯二酚1，2雙加氧酶基因tfdC改造擬南芥，探索植物降解芳香族污染物。氯代鄰苯二酚1，2雙加氧酶在微生物研究中已經(jīng)被證實(shí)具有打開苯環(huán)的能力。本研究中獲得的轉(zhuǎn)基因植株在形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)上與野生型植株沒(méi)有可見的差別。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，tfdC轉(zhuǎn)基因植株對(duì)芳香族化合物鄰苯二酚的耐受性相對(duì)于對(duì)照植株有了顯著的提高，并顯示出顯著提高的吸收和轉(zhuǎn)化鄰苯二酚的能力。HPLC分析結(jié)果進(jìn)一步顯示在植株內(nèi)部檢測(cè)到的鄰苯二酚的代謝產(chǎn)物順，順-己二烯二酸的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于預(yù)期應(yīng)產(chǎn)生的量。據(jù)此，我們推測(cè)植物內(nèi)部可能具有類似于細(xì)菌鄰位降解途徑中TfdC下游的TfdD和TfdE酶活性，使得降解產(chǎn)物順，順-己二烯二酸進(jìn)一步被降解。利用生物信息學(xué)方法檢索擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，我們確實(shí)在植物中發(fā)現(xiàn)了TfdD和TfdE的同源蛋白，而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)TfdC的同源蛋白�？梢姡瑃fdC基因賦予轉(zhuǎn)基因植物的TfdC酶活性在植物降解芳香族化合物過(guò)程中是至關(guān)重要的，也同時(shí)預(yù)示著細(xì)菌來(lái)源的基因在植物降解環(huán)境中芳香族污染物應(yīng)用中的良好前景。 葉綠素酶(EC 3.1.1.14)催化葉綠素降解的第一步反應(yīng)。葉綠素酶基因的克隆推動(dòng)了對(duì)葉綠素酶生理生化特性的研究，也有助于揭示葉綠素酶在植物體內(nèi)作用的機(jī)制。在擬南芥中有兩個(gè)葉綠素酶基因，AtCLH1和AtCLH2。AtCLH1的相關(guān)研究報(bào)道比較多，關(guān)于其體內(nèi)的功能也已有報(bào)道，而對(duì)AtCLH2的研究則相對(duì)較少。本研究中，我們?cè)隗w外表達(dá)純化了由AtCLH2編碼的葉綠素酶2。葉綠素酶2在體外表現(xiàn)出了葉綠素酶的活性。我們還發(fā)現(xiàn)，與由AtCLH1編碼的葉綠素酶1相比，葉綠素酶2在體外達(dá)到最大葉綠素酶活性需要更高濃度的去污劑(Triton X-100)或極性溶液(丙酮)。為了進(jìn)一步研究AtCLH2在植物體內(nèi)的功能，我們采用了RNA干擾的方法抑制了擬南芥中AtCLH2的表達(dá)。同野生型擬南芥相比，RNA干擾的轉(zhuǎn)基因植株中葉綠素含量基本不變，而葉綠素酸酯含量則顯著下降，使得葉綠素與葉綠素酸酯的比值顯著升高。另外，我們還注意到AtCLH1和AtCLH2的表達(dá)譜有一定的差別。我們的結(jié)果顯示AtCLH2在體內(nèi)葉綠素代謝中可能扮演著一個(gè)不同于AtCLH1的角色。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：X172
【圖文】：

鄰苯二酚的平板上，一些野生型種子己經(jīng)不能萌發(fā)或者萌發(fā)后即死亡。在 0.5mM鄰苯二酚的平板上，所有野生型種子都不能萌發(fā)。而在含有 0.5mM順，順一己二烯二酸的平板上，野生型種子依然能發(fā)育出完整的植株(圖1.3)。這就說(shuō)明鄰苯二酚和其代謝產(chǎn)物順，順一己二烯二酸具有明顯的毒性差別，鄰苯二酚對(duì)植物的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于順，順一己二烯二酸。這種毒性的差別使我們可以用鄰苯二酚作為衡量轉(zhuǎn)基因擬南芥中僑尤基因是否具有功能的指示。同時(shí)，我們也注意到，高于 0.4mM的順，順一己二烯二酸對(duì)于植株的發(fā)育也有一定抑制作用，具體表現(xiàn)在對(duì)植株的根發(fā)育有抑制作用(圖 1.3)。這說(shuō)明高濃度的順，順一己二烯二酸對(duì)植株還是具有一定的毒性。

圖1.3鄰苯二酚和順，順一己二烯二酸的植物毒性。Figure1.3Relativetoxieitiesofeateeholandeis，eis一mueonieacidtoArabidoPsis.野生型植株在含有0.1(左)，0.2(中)和0.5mM(右)鄰苯二酚或順，順一己二烯二酸的1/2MS培養(yǎng)基平板1生長(zhǎng)兩周后的形態(tài)觀察同時(shí)，我們考察了27個(gè)T:代CT植系在含有0.1或02mM鄰苯二酚的平板上的表型。研究結(jié)果顯示，盡管幾代植株還存在著遺傳分離，幾乎所有的CT植株還是展現(xiàn)比野生型更高的鄰苯二酚耐受性。根據(jù)以上結(jié)果，我們選擇了CTI一2，CTI一5，CTI一16和CTI一19四個(gè)CT株系用于進(jìn)一步的研究。3.啊C基因在cT植株中的表達(dá)使用Rl’-pCR的方法，驗(yàn)證僑九)基因在T4代純合轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)。內(nèi)源的ACTjl基因作為內(nèi)參。在所分析的四個(gè)CT株系中，都鑒定出一條大小800bP左右的對(duì)應(yīng)于老斌了編碼序列的條帶，而在vT植株中則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的信號(hào)。

圖1.6在土壤中CT植株具有顯著提高的鄰苯二酚耐受性。Figure1.6EnhaneedeateeholtoleraneesofCTPlantsinsoil·A和B，杭株在含有1mM的PNS潤(rùn)濕的土壤中生長(zhǎng)兩周.隨后撼三一天用、mM的鄰笨二酚處理三周。C，以上處理「{，植株鮮重。數(shù)據(jù)通過(guò)t檢驗(yàn)。**代表尸、0.01。D，E和F，植株在PNS潤(rùn)濕的土壤中生長(zhǎng)兩周戈D)，隨后i味三天”〕3mM的鄰苯二酚處理止周(E)，川水恢復(fù)三周(F)。這體現(xiàn)了CT植株對(duì)鄰苯二酚較高的耐受性，這也有利于CT植株在植物降解鄰苯二酚中的應(yīng)用(圖1.SA，B)。6.CT植株在土壤中的鄰苯二酚抗性觀察我們選取野生型和CTI一2株系在土壤中研究了鄰苯二酚對(duì)于種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)的影響。種子被播種在事先用0，l，2，或3mM鄰苯一酚的州S培養(yǎng)基潤(rùn)濕過(guò)的土壤上，放置在培養(yǎng)室中培養(yǎng)。同野生型相比，CTI一2株系的萌發(fā)率更高。在植株萌發(fā)后，用含有O，1，2，或3mM的鄰苯二酚的水進(jìn)行噴灑處理。在一周過(guò)后，更多的CT植株存活下來(lái)。噴灑處理三周后，CTI一2植株展現(xiàn)

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2802317