【摘要】：能源的大量開采和工業(yè)的飛速發(fā)展導(dǎo)致了嚴(yán)重的石油烴類污染,為人體健康和生態(tài)環(huán)境帶來了巨大的危害,已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注。生物修復(fù)技術(shù)在污染物的環(huán)境治理方面具有很高的生態(tài)意義,但石油烴的強疏水性促使它們通常以非水相液體的形式存在,使得生物修復(fù)過程緩慢、效率較低。生物表面活性劑在促進疏水性有機物污染的生物修復(fù)中起到了重要作用,但目前關(guān)于生物表面活性劑協(xié)調(diào)石油烴類污染物生物降解的作用機制方面的研究還不多。本文以鼠李糖脂為典型代表,系統(tǒng)的研究了其對菌體細胞表面疏水性影響的作用機制,考察了該生物效應(yīng)對石油烴生物降解的影響;還開展了鼠李糖脂的增溶作用對石油烴生物降解的影響。在此基礎(chǔ)上,本文還考察了多種形態(tài)的正十六烷的生物降解,深入的探究鼠李糖脂的增溶作用與石油烴生物可利用性之間的關(guān)聯(lián)。這些工作為生物表面活性劑在石油烴污染的生物修復(fù)中的高效應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)。本文的具體研究工作及成果包括以下4個部分的內(nèi)容:第1部分介紹了鼠李糖脂的純化方法和低于臨界膠束濃度(CMC)濃度下鼠李糖脂/烷烴聚集體的形成。首先,利用柱層析和薄層色譜法純化了鼠李糖脂的粗成品,得到了單鼠李糖脂和二鼠李糖脂兩種產(chǎn)品,采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行成分鑒定。結(jié)果顯示單鼠李糖脂的主要成分為RhaC_(10)C_8、RhaC_(10)C_(10)、RhaC_(10)C_(12),二鼠李糖脂中仍含有單糖脂RhaC_(10)C_(10)。該研究結(jié)果表明,柱層析技術(shù)用于鼠李糖脂的深度提純有較好的效果。烷烴的水相分配數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,低于CMC的單鼠李糖對正十六烷表現(xiàn)出增溶作用,利用冷凍透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該濃度溶液中也有聚集體的形成。第2部分在先前的研究基礎(chǔ)上考察了鼠李糖脂處理P.aeruginosa CCTCC AB93066細胞表面后,菌體對單獨相和膠團化正十六烷的降解情況,以更好的了解鼠李糖脂的生物效應(yīng)對烷烴類污染物生物降解的影響。在降解實驗中,選用了不同濃度的鼠李糖脂處理菌體表面。結(jié)果顯示,1 CMC的鼠李糖脂處理對菌體的生長有微弱的抑制作用,而10 CMC鼠李糖脂的處理加速了單獨相正十六烷的生物降解。后者可能是鼠李糖脂增強了正十六烷的界面吸收或細胞表面的通透性的緣故。但是,不管菌體是否經(jīng)過鼠李糖脂處理,都不能降解10 CMC鼠李糖脂增溶的正十六烷,說明膠團化形態(tài)的正十六烷不能被該菌體攝取和降解。這些結(jié)果對評估鼠李糖脂生物表面活性劑在石油烴污染修復(fù)應(yīng)用中具有重要意義。在第3部分中,研究了P.aeruginosa ATCC 9027對鼠李糖脂、辛烷酚乙酯(Triton X-100)或十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)增溶態(tài)正十六烷的降解,探討表面活性劑增溶作用對烷烴生物降解的影響。5 CMC濃度表面活性劑對正十六烷的增溶能力大小為Triton X-100鼠李糖脂SDBS。鼠李糖脂存在的培養(yǎng)基中,正十六烷的降解和菌體生長速率明顯提高,表明鼠李糖脂的增溶作用促進了正十六烷的生物降解。而化學(xué)表面活性劑Triton X-100的生物降解促進了菌體的生長,卻延緩了細胞對正十六烷的攝取。SDBS增溶的正十六烷的生物降解性反而低于單獨相的正十六烷,說明其增溶作用不利于正十六烷的生物降解,這可能是由于SDBS在水-有機污染物的界面上產(chǎn)生了屏障作用。從結(jié)果中可以推斷出,利用表面活性劑提高石油烴有機污染物的表觀溶解度并不一定能夠促進其生物降解。在第4部分中,采用以鼠李糖脂增溶態(tài)、單獨相和多相形態(tài)正十六烷作為碳源的液體培養(yǎng)體系,深入地探究了鼠李糖脂增溶作用對正十六烷生物可利用性的影響。實驗結(jié)果顯示,P.aeruginosa ATCC 9027,一種鼠李糖脂生產(chǎn)菌,對鼠李糖脂增溶的正十六烷的攝取高于單獨相的正十六烷,說明鼠李糖脂的增溶作用提高了正十六烷的生物可利用性。對于P.putida CICC 20575,一種不產(chǎn)生但降解鼠李糖脂的假單胞菌,對鼠李糖脂增溶態(tài)和多相狀態(tài)正十六烷的攝取均低于單獨相形態(tài)的正十六烷。結(jié)果表明,鼠李糖脂增溶作用對正十六烷的生物可利用性的影響取決于細菌與鼠李糖脂的相容性。該研究進一步深化了疏水性有機化合物(HOCs)和生物表面活性劑的相關(guān)認知,對生物表面活性劑在生物修復(fù)中的應(yīng)用具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：X74;X172
【圖文】：

醇。生物表面活性劑的臨界膠束濃度通常在 1~200 mg/L 范圍之內(nèi)，則為 500~1500 Da[49]。相比大量使用的合成型表面活性劑，高度的專一降解性和生物相容性等這些明顯的優(yōu)勢使得生物表面活性劑具有很高的。例如，在表面活性劑增溶萘的對比實驗中，Rhodococcus species 413A脂類生物表面活性劑的毒性明顯低于 Tween 80[11]。據(jù)報道，生物表面活現(xiàn)更高的表面活性和乳化性能[50]。.2 鼠李糖脂鼠李糖脂是研究最為廣泛的一類陰離子型生物表面活性劑。它由 L-鼠水性的頭基）和 β-羥基脂肪酸基團（疏水性的尾鏈）組成[51, 52]。1949 is 等人[53]從銅綠假單胞菌胞外分泌物中觀察到鼠李糖脂的存在，這也是李糖脂的首次報道。目前，已發(fā)現(xiàn) 60 余種鼠李糖脂的同系物[54]。辨別物主要是通過脂肪酸基團的飽和度和鏈長之間的差異[55]。大量研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)生成的鼠李糖脂，其組成和產(chǎn)量取決于發(fā)酵罐裝置參數(shù)，發(fā)酵液 pH 成分，基質(zhì)和溫度[11]。

鼠李糖脂協(xié)調(diào)石油烴類污染物生物降解的機制研究的 KDO 含量恒定，即可以通過脂多糖和 KDO 間的比例關(guān)系計算微生物細胞的脂多糖含量。對于革蘭氏陰性菌細胞外膜脂多糖的提取，實驗室多采用物理、化學(xué)法等較溫和的手段破壞脂多糖與細胞壁間的結(jié)合，盡可能保證脂多糖結(jié)構(gòu)性質(zhì)完整；之后再利用一些方法去除雜質(zhì)提取之多聽�，F(xiàn)階段較多采用酚水法。

吸附于細胞表面的鼠李糖脂的方向性決定了 CSH 的變化趨勢[122]。如圖1.3 所示，羧基官能團/鼠李糖與細胞表面極性結(jié)構(gòu)（如脂多糖的 O-抗原部分）間的相互作用可能引起鼠李糖脂在細胞表面吸附的發(fā)生，從而增強 CSH，這些相互作用力主要包括氫鍵、偶極、靜電或短程力。另一方面，細胞表面的非極性結(jié)構(gòu)（如脂質(zhì)和部分蛋白）與鼠李糖脂的疏水性尾鏈間的疏水性作用力和范德華力也能夠促使鼠李糖脂吸附作用的發(fā)生，從而降低 CSH。換言之，微生物細胞在疏水或親水性界面的黏附行為可以簡述為：鼠李糖脂的疏水（或親水）基團與具有相對較高（或低）的 CSH 的微生物細胞接觸，使得鼠李糖脂的親水（或疏水）基團暴露于環(huán)境中，從而降低（或增強）菌體的 CSH。從本質(zhì)上講，鼠李糖脂的方向性即鼠李糖脂單體的一個部位與細胞表面化學(xué)基團間產(chǎn)生相互作用，引起鼠李糖脂相反極性部位在環(huán)境中的暴露。圖 1.3 鼠李糖脂在微生物細胞表面的方向性Figure 1.3 Orientation of rhamnolipids at cell surface of microorganisms方向性模型傾向于根據(jù)細胞表面情況將疏水區(qū)轉(zhuǎn)化為親水區(qū)或?qū)⒂H水區(qū)改變?yōu)槭杷畢^(qū)。已有許多研究報道了鼠李糖脂在細胞表面的吸附可以改變 CSH。Zhao等人[123]測定了 Bacillus subtilis BUM 的初始 CSH 為 73.5%，添加鼠李糖脂后，隨著鼠李糖脂在細胞表面吸附量的增加 CSH 開始明顯下降。對于相對呈現(xiàn)親水性的Pseudomonas aeruginosa

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