【摘要】：N-雜環(huán)化合物存在于工農(nóng)業(yè)廢棄物中,具有致癌、致畸、致突變等性質。尼古丁作為N-雜環(huán)化合物的一種,是高毒性的環(huán)境污染物。利用微生物去除尼古丁等環(huán)境污染物是最為可行的修復方法。課題組前期分離獲得了一株高效降解尼古丁的菌株——惡臭假單胞菌S16(Pseudomonas putida S16),它采用吡咯途徑代謝尼古丁。然而,假單胞菌屬細菌代謝尼古丁的吡咯途徑還很不完整:2,5-二羥基吡啶代謝的途徑?jīng)]有被揭示;轉化3-琥珀酰吡啶(SP)的關鍵酶及其基因未知。另外,假單胞菌屬細菌代謝尼古丁的調(diào)控機制還沒有被報道。本論文在前期菌株S16全基因組測序和比較基因組分析的基礎上,克隆獲得了馬來酸異構酶基因iso,在大腸桿菌中異源表達,驗證了其編碼產(chǎn)物Pp-Iso為菌株S16中催化尼古丁代謝吡咯途徑最后一步(馬來酸生成富馬酸)的酶。在過去的幾年中,課題組為了尋找尼古丁代謝吡咯途徑中催化3-琥珀酰吡啶(SP)生成6-羥基-3-琥珀酰吡啶(HSP)的酶已作出了很多努力,包括基因組文庫篩選、野生蛋白純化等,但并未獲得目的基因。本論文在菌株S16基因組和差異蛋白質組的基礎上,通過序列分析定位了菌株S16中編碼轉化SP生成HSP酶的基因簇spmABC,其由3個重疊的基因spmA、spmB和spmC組成。構建了spmABC基因簇失活的突變株,在生長體系和休止細胞體系中驗證了異型多聚體SpmABC的功能為SP羥化酶。然而在大腸桿菌中沒有表達出有活性的SP羥化酶,分析文獻發(fā)現(xiàn),鉬喋呤胞嘧啶二核苷酸(MCD)是SP羥化酶必不可少的輔因子,而且大腸桿菌不能合成MCD。因此,我們構建了spmABC基因簇回補的突變株,并在假單胞菌中成功表達了有活性的SP羥化酶。尼古丁代謝的生理生化機制已基本清楚,然而調(diào)控方面的研究開展的很少。本論文以菌株S16中nic2基因簇(包括基因hspB,orf5,iso,hpo,nfo和ami)為研究對象,研究了尼古丁代謝吡咯途徑的調(diào)控機制。定位了假單胞菌屬細菌中第一個參與尼古丁代謝的調(diào)控基因nicR2,構建了基因nicR2失活和回補的突變株,驗證其功能為nic2操縱子的阻遏蛋白。凝膠阻滯和DNase I footprinting實驗確定了NicR2的結合位點包含28 bp的回文序列,其效應物是HSP。進一步對菌株S16中調(diào)控蛋白NicR2與DNA的結合機制進行了研究,通過大分子相互作用實驗確定了兩個NicR2二聚體協(xié)同結合到DNA上,并通過凝膠阻滯實驗確定了對NicR2的協(xié)同結合起到關鍵作用的DNA序列為(“CTATATGN6~8CATATAA”)。首次證實了回文序列的半位點(half-site)能夠結合NicR2,并通過凝膠過濾和蛋白交聯(lián)實驗檢測到了NicR2四聚體,暗示NicR2蛋白-蛋白之間存在相互作用。在此基礎上,本論文提出了一種新的HTH型調(diào)控蛋白結合DNA的模型:調(diào)控蛋白以四聚體的形式特異地結合一個回文序列,每個二聚體結合回文序列的一個半位點。這種結合方式不同于其他用HTH結合DNA的蛋白,反而與某些β-片型調(diào)控蛋白結合DNA的方式類似。本研究豐富了原核生物轉錄調(diào)控的多樣性。
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：X172
【圖文】：

4圖 1.1 微生物分解代謝尼古丁的途徑[7, 8, 27]途徑 A 是節(jié)桿菌屬微生物采用的吡啶途徑；途徑 B 是假單胞菌屬微生物采用吡咯途徑；途徑 C 是推測的根癌農(nóng)桿菌分解代謝尼古丁的吡啶-吡咯雜合途徑。Fig 1.1 The pathways of nicotine catabolism in bacteria.

圖 1.2 節(jié)桿菌中尼古丁代謝相關基因（簇）[7]ORF 下方的數(shù)字代表其編碼蛋白的氨基酸數(shù)量Fig. 1.2 Arrangement of genes involved in nicotine catabolism on megaplasmid pAO1.2. 假單胞菌屬細菌代謝尼古丁分子生物學研究假單胞菌屬細菌代謝尼古丁吡咯途徑的分子機制直到近年來才取得突破。其

只有噬尼古丁節(jié)桿菌 pAO1 中的兩個轉錄調(diào)控蛋白（圖1.3）。1. HdnoR節(jié)桿菌中代謝L-尼古丁的第二步反應是由6-羥基-L-尼古丁氧化酶6HLNO催化的，該酶只能催化 L-型對映體的降解，然而在該菌株中，L-型尼古丁也能夠誘導 6hdno 基因的轉錄和表達。6hdno 基因位于大質粒 pAO1 上 ORF111 和 ORF113之間，這兩個 ORF 都編碼透性酶。RT-PCR 和引物延伸實驗都表明 6hdno 基因單獨構成一個操縱子，而且是誘導型表達的。6hdno 下游的 ORF114 編碼轉錄調(diào)控

【共引文獻】

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本文編號：2796421