發(fā)布時(shí)間：2020-08-14 10:12

【摘要】：生物污損在全球范圍內(nèi)每年造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)幾百億美元,生物污損防治成為世界范圍的難題。傳統(tǒng)防污漆中的毒性化合物由于毒性大、難降解,使用受到越來(lái)越嚴(yán)厲的控制,尋找高效的環(huán)境友好的抗污損化合物成為目前迫切需要解決的問(wèn)題。海綿具有抵御生物污損的化學(xué)防御機(jī)制,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),海綿的抗污損活性物質(zhì)的真正生產(chǎn)者是其附生微生物,因此海綿附生微生物成為尋找抗污損天然產(chǎn)物的良好來(lái)源。微型生物污損——生物膜對(duì)大型污損生物的附著和后續(xù)生長(zhǎng)起關(guān)鍵作用,并最終導(dǎo)致復(fù)雜的污損生物群落的形成,若前期生物膜演替過(guò)程被阻止則后續(xù)大型生物,特別是硬殼生物的附著將被阻止,因此對(duì)材料表面初期微型生物污損進(jìn)行防控,不僅能夠避免生物膜帶來(lái)的危害,而且能夠防止大型污損生物的附著。在光線(xiàn)能照射到的范圍內(nèi),生物膜的主體是微型植物——硅藻。因此,在生物污損防治中抗硅藻附著是避免后續(xù)大型生物附著的必須和關(guān)鍵的一步,開(kāi)發(fā)對(duì)包括硅藻在內(nèi)的各種污損生物廣譜有效的抗污損材料,是解決生物污損問(wèn)題的必然途徑。硅藻的殼縫系統(tǒng)和胞外多聚物(EPS)對(duì)于生物膜的形成和發(fā)育具有重要作用,都是影響底棲硅藻附著的重要因素。本研究以抗硅藻附著的活性菌株和活性菌株粗提物為工具,以底棲硅藻形成的生物膜和分泌的胞外多聚物為研究對(duì)象,研究底棲硅藻在菌株或粗提物干擾下,附著性能受到的影響。用抗硅藻附著生物測(cè)試方法,從海綿附生微生物菌庫(kù)中篩選出活性菌株；用活性菌株和底棲硅藻進(jìn)行菌藻直接接觸的對(duì)峙試驗(yàn),確定菌株抗硅藻附著的活性來(lái)源；用活性菌株粗提物對(duì)硅藻進(jìn)行處理,研究硅藻生物膜的形成情況,以及硅藻胞外多聚物的分泌情況,并對(duì)胞外多聚物進(jìn)行分離純化,分析其單糖組成和變化,尋找與硅藻附著性能密切相關(guān)的單糖或單糖組合。研究的結(jié)果如下：1、從美國(guó)圣璜島海綿附生微生物菌庫(kù)中的224個(gè)樣品中篩選出24個(gè)具有抗硅藻附著活性的菌株集合。對(duì)224個(gè)樣品中已經(jīng)完成種屬鑒定的菌株樣品進(jìn)行多樣性分析,它們分屬于4個(gè)門(mén)類(lèi)23個(gè)屬,85%的菌株集中在厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén),Bacillus屬的菌株最多。對(duì)224個(gè)菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)和小規(guī)模發(fā)酵,獲取粗提物。在24孔板中進(jìn)行粗提物濃度為100μg/mL的抗硅藻附著急性試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)海綿附生微生物菌株粗提物對(duì)硅藻的附著有明顯的影響,對(duì)硅藻的附著表現(xiàn)出中性、抑制和促進(jìn)的效果,粗提物的效果與硅藻的種類(lèi)相關(guān)。從抗污損活性即抑制硅藻附著的角度出發(fā),從224個(gè)菌株中共篩選出24個(gè)活性菌株,粗提物濃度在100μg/mL時(shí),至少能同時(shí)抑制四種硅藻附著。從24個(gè)活性菌株粗提物中選取5個(gè)樣品進(jìn)一步降低濃度,測(cè)試粗提物在不同濃度下對(duì)兩種硅藻Nitzschia closterium和Amphora sp的抑制效果的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著粗提物濃度的降低,菌株粗提物抑制硅藻附著的能力也隨之降低。所有粗提物樣品針對(duì)Amphora sp的EC50均高于其針對(duì)N.closterium的EC50。也就是說(shuō),同一個(gè)粗提物樣品對(duì)不同硅藻附著的抑制效果差別顯著。推測(cè)不同硅藻對(duì)粗提物處理的敏感性差異可能與硅藻的殼縫系統(tǒng)密切相關(guān)。為了確定抗硅藻污損天然產(chǎn)物的菌種來(lái)源,綜合菌株的形態(tài)特征和基因序列分析,對(duì)兩個(gè)未知種屬的活性菌株進(jìn)行了菌種鑒定,UST050418-708被鑒定為Psychrobacter arcticus, UST050418-694被鑒定為Microbacterium testaceum。2、本文將活性菌株和附著硅藻共培養(yǎng),研究菌藻之間的關(guān)系。在24孔板中進(jìn)行4株活性細(xì)菌和硅藻Stauroneis sp.直接對(duì)峙實(shí)驗(yàn),改變菌藻比例,觀(guān)測(cè)硅藻的附著率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌藻比例高時(shí),各活性菌株抑制硅藻附著的活性明顯增強(qiáng)；各菌株在不同菌藻比例條件下,抑制硅藻附著活性最強(qiáng)的部分一般都集中在上清液,而菌體的抑制活性相對(duì)較弱,有的甚至有可能刺激硅藻附著,全菌液的活性強(qiáng)弱一般處于上清液和菌體之間。本研究在三角瓶中進(jìn)行活性菌株UST050418-708和硅藻Stauroneis sp的大體積菌藻對(duì)峙試驗(yàn),共培養(yǎng)16天后發(fā)現(xiàn),活菌和全菌液都有一定的促進(jìn)硅藻生長(zhǎng)的作用,滅活菌對(duì)硅藻生長(zhǎng)影響不大,而上清液抑制硅藻的生長(zhǎng)。同時(shí),活性菌株也影響硅藻的附著,會(huì)改變硅藻細(xì)胞在生物膜和懸浮部分之間的分布,菌株上清液使附著的硅藻比例減少,活菌體和滅活菌體使附著硅藻的比例增大。推測(cè)菌體滅活過(guò)程使細(xì)菌的細(xì)胞破裂并使胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或促進(jìn)硅藻附著的物質(zhì)釋放出來(lái),同時(shí)抑制硅藻附著的活性成分在滅活菌體的過(guò)程中失活分解,導(dǎo)致附著硅藻比例上升。3、本文用活性菌株UST050418-708的粗提物處理兩種硅藻Stauroneis sp和Amphora sp.,然后進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng),研究活性菌株粗提物對(duì)兩種硅藻生長(zhǎng)、附著的影響,以及對(duì)硅藻胞外多聚物EPS的分泌和單糖組成的影響,并比較兩種硅藻的反應(yīng)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),活性菌株粗提物不抑制硅藻的生長(zhǎng),但是影響硅藻細(xì)胞在生物膜和懸浮狀態(tài)的分布。粗提物處理使硅藻Stauroneis sp形成生物膜的細(xì)胞比例降低,但對(duì)Amphora sp的細(xì)胞分布影響不大；硅藻EPS分布的變化與硅藻細(xì)胞在培養(yǎng)體系中分布的變化一致；粗提物改變單位硅藻細(xì)胞EPS的分泌量,高濃度處理使Stauroneis sp每克干藻的EPS產(chǎn)量大幅上升,而高濃度處理下Amphora sp的每克干藻的EPS產(chǎn)量與對(duì)照持平。兩種硅藻都出現(xiàn)單位藻細(xì)胞的生物膜TB-EPS增加,推測(cè)可能硅藻為了保持附著狀態(tài),需要產(chǎn)生大量的緊密粘附性EPS來(lái)對(duì)抗干擾；兩種硅藻對(duì)粗提物處理的反應(yīng)程度受硅藻本身生活型的影響。4、將兩種硅藻的EPS粗品進(jìn)行有機(jī)溶劑洗滌去脂、Sevage法去蛋白、透析除鹽后,經(jīng)TFA完全酸水解,經(jīng)PMP柱前衍生化,利用HPLC方法分析EPS的單糖組成并計(jì)算各單糖的分子摩爾比。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種生活型不同的硅藻EPS的單糖組成不同。硅藻Stauroneissp.的EPS由9-10種單糖組成,總EPS含有9種單糖。按照出峰順序依次是Man, Glc-N、 Rha、Glc-A、Glc-NAC、Gl、Gal、Xyl和Fuc,不含Gal-A和Ara。Amphora sp.的總EPS由12種單糖組成,除了包含Stauroneis sp.所有的9種單糖和Gal-A外,還含有兩種未知單糖。從單糖種類(lèi)數(shù)上看,Amphora sp.比Stauroneissp.的EPS單糖種類(lèi)豐富。同一種硅藻不同來(lái)源的EPS優(yōu)勢(shì)單糖不同。硅藻Stauroneis sp.的細(xì)胞外粘附性EPS (TB-EPS),來(lái)自懸浮細(xì)胞的F-TB-EPS和來(lái)自生物膜細(xì)胞的BF-TB-EPS,兩者的第一優(yōu)勢(shì)單糖都是GIc,·占比分別達(dá)到38%和59%。但是,F-TB-EPS的第二優(yōu)勢(shì)單糖是Gal,而B(niǎo)F-TB-EPS的第二優(yōu)勢(shì)單糖則是Man。硅藻Amphora sp懸浮細(xì)胞的TB-EPS占優(yōu)勢(shì)的單糖是Xyl,而生物膜細(xì)胞的TB-EPS優(yōu)勢(shì)單糖有三種,分別是Man、Glc-A和Gal,三者占比相當(dāng)。不同硅藻的EPS差異明顯,但來(lái)源相似的EPS具有一定的相似性�？扇苄訣PS (SL-EPS)來(lái)自于全部細(xì)胞,兩種硅藻Stauroneis sp.和Amphora sp.的SL-EPS均以Xyl和Glc-A為主要單糖。兩種硅藻在對(duì)活性菌株粗提物的反應(yīng)中,變化最小的EPS都是來(lái)自全部硅藻細(xì)胞的可溶性EPS (SL-EPS)。無(wú)論粗提物濃度高低,該部分EPS的優(yōu)勢(shì)單糖均沒(méi)有發(fā)生變化,僅僅是優(yōu)勢(shì)單糖的占比發(fā)生一些變化。從各個(gè)部位的EPS總體來(lái)看,Stauroneis sp有4種特征單糖,分別是Xyl、Glc、Man和Gal,全部都是中性單糖；Amphora sp.有5種特征單糖,分別是Xyl、Gal、Man,還有Glc-A和GlcN,除了中性單糖,還有糖巍和葡萄糖胺。一般情況下,優(yōu)勢(shì)單糖往往是粗提物處理引起變化發(fā)生的熱點(diǎn)位置,但是也有非優(yōu)勢(shì)單糖受到處理后發(fā)生明顯變化,而成為熱點(diǎn)位置的情況。關(guān)于硅藻附著性能和單糖組成之間的關(guān)系的分析表明,附著性能強(qiáng)的硅藻Amphora sp.的EPS中“氨基己糖+糖醛酸”、糖醛酸、Glc-A的摩爾百分含量均高于附著性能弱的硅藻Stauroneis sp.。尤其是Glc-A,在附著性能強(qiáng)的Amphora sp.的EPS中是優(yōu)勢(shì)單糖,在附著性能弱的硅藻Stauroneis sp.中摩爾百分含量相對(duì)較低。當(dāng)進(jìn)行活性菌株粗提物處理時(shí),摩爾百分含量下降幅度和處理強(qiáng)度在兩種硅藻中均一致,說(shuō)明Glc-A可能和此兩種硅藻的胞外EPS的粘性、硅藻附著性能有較大的相關(guān)性。本論文的研究成果不僅有利于我們加深對(duì)海綿類(lèi)生物的防污損化學(xué)防御機(jī)制的理解,還有利于加深我們對(duì)污損生物硅藻附著機(jī)制的理解,也可以為我們提供高效無(wú)毒的抗污損活性化合物來(lái)源應(yīng)用于抗污損技術(shù)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：X55
【圖文】：

樣品邋ＵＳＴ０５０４１８－１００，ＵＳＴ０５０４１８－３１５，ＵＳＴ０５０４１８－３巧，ＵＳＴ０５０４１８－３８０邋和逡逑ＵＳＴ０５０４１８－６８３邋針對(duì)邋如ｏｒａ邋ｓｐ．的邋ＥＣｓｏ邋分別是邋１５．４０，邋２１．１９，邋１２．５３，邋１９．扣和邋２１．０７惦／ｍｌ，逡逑而針對(duì)Ｗｃ如似亂ｍ的ＥＣｓｏ的分別是３．２２，５．６２，１．４７，３．８８，和８．巧雌／ｍｌ邋（見(jiàn)圖２－３）。逡逑所所有樣品針對(duì)＾ｍｐ＆ｏｒａｓｐ．的ＥＣｓｏ也均高于其針對(duì)ｃ／ｏｓｔｏ＇／ｗｍ的ＥＣｓｏ。這些結(jié)果逡逑充分說(shuō)明，由于s暝逯?jǐn)S嗪蛻硤匭緣牟煌�，同一庚e痔崳镅范圓煌拊甯階諾囊種菩у義瞎畋鶚嗆芟災(zāi)�。辶x希玻常戳街昃咭種苨暝甯階嘔钚躍甑鬧質(zhì)艏ㄥ義锨拔乃⑾值幕钚躍曛屑杭ǖ木攴質(zhì)粲誆煌氖�，其中势A能韁甌冉襄義隙�。哉斷养侯^⒔突钚躍甑墓討�，发现未知仲|(zhì)艫幕钚躍輳眨櫻裕埃擔(dān)埃矗保福罰埃負(fù)灣義希眨櫻裕埃擔(dān)埃矗保福叮梗幢冉弦子諗嘌�，且发蕉d蟠徊锏牟懇脖冉洗�，易诱燅得足量粗虓ｅP義弦虼耍運(yùn)土礁齷钚躍杲辛酥質(zhì)艏�。辶x希玻常矗卞澹眨櫻裕埃擔(dān)埃㈠澹福罰埃婦淶男翁顏麇義希眨櫻裕埃擔(dān)埃矗保福罰埃婦暝冢校俟?fàn)C迮嘌信嘌蔡旌�，形态学观草灥a骶涑適氚咨�，辶x轄殘�，直径２邋ｍ４~笥遙礱婀饣�，边缘整齐（见哇E玻矗ｅ義

本文編號(hào)：2792894