【摘要】：三氯乙烯作為一種重要的工業(yè)溶劑由于其優(yōu)良的性質(zhì)曾被廣泛應(yīng)用于金屬脫脂、干洗、農(nóng)藥殺蟲、醫(yī)藥麻醉等領(lǐng)域,通過毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可對(duì)人體和環(huán)境生物造成危害,已被許多國(guó)家列入“優(yōu)先控制化合物”和“疑似致癌物質(zhì)”名單,但在使用過程中由于人為的不正當(dāng)處置以及泄露已被大量釋放到地下水環(huán)境中成為最常檢出的含氯有機(jī)污染物,因此急需對(duì)三氯乙烯污染地下水進(jìn)行修復(fù)。生物厭氧還原脫氯是眾多技術(shù)中成本較低且對(duì)環(huán)境友好的修復(fù)技術(shù)。但運(yùn)用于實(shí)際的微生物資源還相對(duì)較少,對(duì)混菌的研究了解相比于單菌也相對(duì)匱乏,特別是國(guó)內(nèi)還尚無相關(guān)報(bào)道。因此本論文以一組馴化培養(yǎng)的能將TCE完全脫氯降解為ETH的混菌為研究對(duì)象,首先對(duì)其降解特性及分子生物學(xué)特性進(jìn)行比較系統(tǒng)全面的分析。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了其在不利環(huán)境脅迫條件下的適應(yīng)性,并運(yùn)用碳-特定化合物同位素比值分析技術(shù)研究了該混菌在降解含氯乙烯過程中的13C穩(wěn)定同位素分餾規(guī)律,最后通過室內(nèi)模擬研究了生物激活以及生物強(qiáng)化方式原位修復(fù)TCE污染地下水的效果。在對(duì)該混菌降解特性及分子生物學(xué)特性進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn),該菌能利用甲醇、乳酸鈉,氫氣(+乳酸鹽)等不同的基質(zhì)作為電子供體將TCE還原脫氯為對(duì)環(huán)境無害的終產(chǎn)物ETH,降解TCE的同時(shí)有甲烷生成。此外,該菌能降解所有類型的含氯乙烯,由此表明該菌是一組產(chǎn)乙烯脫鹵球菌和其他非脫氯菌共存的混菌,且體系中可能同時(shí)存在不同類型的產(chǎn)乙烯脫鹵球菌。該混菌在低溫、酸性等不利條件下脫氯速率降低,但最終可將TCE緩慢的轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物ETH。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明混菌對(duì)TCE、cis-1,2-DCE的最大降解速率大于VC,而半速率常數(shù)表明混菌在還原脫氯過程中對(duì)三種氯代乙烯的親和力差異不明顯。宏基因組測(cè)序群落結(jié)構(gòu)分析表明混菌中除了產(chǎn)乙烯脫鹵球菌,其他非脫氯菌包括為其提供電子供體、碳源的如醋酸桿菌屬和與其競(jìng)爭(zhēng)的產(chǎn)甲烷菌等,且這些非脫氯菌的相對(duì)豐度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于產(chǎn)乙烯脫鹵球菌屬。特異性PCR技術(shù)也檢測(cè)到產(chǎn)乙烯脫鹵球菌的存在,且證明該混菌中同時(shí)共存多種含氯乙烯還原脫氯功能基因。該混菌中脫氯功能菌和非脫氯菌共存,為了分析非脫氯菌可能起到的作用以及與功能菌的關(guān)系,我們進(jìn)一步對(duì)該混菌在不利環(huán)境脅迫條件下的適應(yīng)性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,混菌在培養(yǎng)基中鈷胺素缺乏的條件下仍然能夠徹底還原TCE至ETH,在不含鈷胺素的培養(yǎng)基中繼續(xù)加入2-溴乙烷磺酸鈉及氨芐青霉素分別抑制混菌中的古菌和細(xì)菌后,前者雖然降解速率變慢,但TCE仍能完全轉(zhuǎn)化為ETH,而連續(xù)添加氨芐青霉素的處理TCE不能轉(zhuǎn)化為ETH,加入鈷胺素后恢復(fù)正常。宏基因組測(cè)序結(jié)果表明混菌中的未分類的凍球菌屬和未分類的螺旋體科是最有可能合成該物質(zhì)的細(xì)菌。氧氣的加入使混菌降解TCE速率受到抑制,但隨著氧氣的消耗,脫氯反應(yīng)被重新啟動(dòng)且最終轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中有ETH的生成;熒光定量PCR結(jié)果顯示混菌中含vcr A基因的產(chǎn)乙烯脫鹵球菌相比于含tce A基因的產(chǎn)乙烯脫鹵球菌對(duì)氧氣更敏感;混菌中多種非脫氯可共同發(fā)揮作用負(fù)責(zé)氧氣消耗使TCE的還原脫氯被重新啟動(dòng);可逆性實(shí)驗(yàn)表明暴露氧氣的混菌重新正常培養(yǎng)可以恢復(fù)到與正常條件相似的水平。混菌中的脫氯菌負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化TCE至終產(chǎn)物ETH,而其他共存的非脫氯菌雖然未參與直接還原脫氯,但對(duì)維持體系的相對(duì)穩(wěn)定扮演著重要的作用,因此在復(fù)雜不利脅迫環(huán)境下,混菌相比于單菌具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和適應(yīng)性。在進(jìn)行修復(fù)效果評(píng)價(jià)時(shí),常規(guī)的濃度監(jiān)測(cè)往往受到如吸附、稀釋、揮發(fā)、溶解等物理因素的影響,近年來運(yùn)用碳-特定化合物同位素比值分析技術(shù)(C-CSIA)可以有效的區(qū)分物理以及生物化學(xué)作用,但關(guān)于復(fù)雜混菌的同位素分餾規(guī)律還不明確。通過對(duì)該混菌的13C穩(wěn)定同位素分餾規(guī)律進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn):混菌在降解TCE及cis-1,2-DCE過程中均產(chǎn)生碳穩(wěn)定同位素分餾效應(yīng),且cis-1,2-DCE反應(yīng)過程中13C富集作用強(qiáng)于TCE。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下混菌對(duì)TCE及cis-1,2-DCE的碳同位素富集因子分別為-7.24±0.59‰和-14.60±1.71‰。培養(yǎng)條件、群落組成等因素的改變不會(huì)造成該混菌碳同位素富集因子的變化,不同處理之間擬合得到的碳同位素富集因子在95%置信區(qū)間內(nèi)無顯著性差異,表明該混菌的碳同位素富集因子具有一定的特異性及穩(wěn)定性。該混菌中含tce A和vcr A基因的產(chǎn)乙烯脫鹵球菌共存,由于不同種類的脫氯菌降解TCE時(shí)往往得到不同的碳同位素富集因子,表明混菌中的兩種產(chǎn)乙烯脫鹵球菌可能分別負(fù)責(zé)TCE降解的不同階段。同位素比值分析技術(shù)能有效的去除物理因素的干擾,且僅需要對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行研究分析,在生物降解效果的預(yù)測(cè)上具有較強(qiáng)的適用性和較高的準(zhǔn)確性。最后通過室內(nèi)模擬研究了生物激活以及生物強(qiáng)化方式原位修復(fù)TCE污染地下水的效果。結(jié)果表明,沿水流的對(duì)流作用以及受重力影響的向下遷移是影響TCE在模擬槽內(nèi)分布的兩個(gè)主要因素。在33周的模擬修復(fù)中,生物激活對(duì)TCE的還原脫氯起到的效果不顯著。生物強(qiáng)化方式從第19周開始在水流下游監(jiān)測(cè)井中檢測(cè)到脫氯產(chǎn)物cis-1,2-DCE,VC和ETH。土著菌中的微生物種類復(fù)雜多樣,電子供體的添加對(duì)某些微生物起到一定的激活效果。但土著菌中不含有能將TCE完全轉(zhuǎn)化為ETH的產(chǎn)乙烯脫鹵球菌屬,需要通過添加強(qiáng)化菌的方式起到預(yù)期的脫氯效果。模擬槽內(nèi)相對(duì)較低的溫度(8-15oC)和由此導(dǎo)致的低功能微生物含量是可能導(dǎo)致生物強(qiáng)化修復(fù)TCE還原脫氯啟動(dòng)延長(zhǎng)的原因。碳穩(wěn)定同位素分析結(jié)果表明物理因素影響模擬槽內(nèi)的TCE濃度分布及變化,但不會(huì)造成碳穩(wěn)定同位素分餾現(xiàn)象。還原脫氯啟動(dòng)前模擬槽內(nèi)穩(wěn)定的13C同位素含量表明TCE不存在其他轉(zhuǎn)化降解途徑。降解啟動(dòng)后運(yùn)用不同方法計(jì)算的到的降解率各不相同,碳同位素分析技術(shù)表征本質(zhì)上由生物作用所造成的TCE降解,基于該方法得到的降解率反映了生物作用所造成的TCE降解。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：X523
【圖文】：

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文dehalorespiration，halorespiration 或 chlororespiration）[47, 48]。如圖 1.1 所示E 在第一步脫氯取代中可以轉(zhuǎn)化為 cis-1,2-DCE 和 trans-1,2-DCE，而后繼續(xù)形成 VC、ETH[49]。各脫氯步驟釋放的能量分別為-166.1 KJ/mol，-144.8 KJ及-154.5 KJ/mol[50]。

技術(shù)路線

圖 2.1 宏基因組分類測(cè)序項(xiàng)目流程圖Fig. 2.1 The flow diagram of metagenomic analysis用于群落結(jié)構(gòu)分析的核基因組總 DNA 采用 E.Z.N.A. 土壤總 DNA 提盒進(jìn)行提�。∣MEGA, USA）。提取后收集的總DNA用Qubit2.0檢測(cè)DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性后根據(jù)測(cè)定的濃度結(jié)果確定PCR反應(yīng)的板量。反應(yīng)體系為 50 μL，用引物 338F 5’-barcode-ACTCCTACGGGAGGA-3’和 806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’對(duì)細(xì)菌和古菌 16S rRV3-V4 可變區(qū)分別進(jìn)行擴(kuò)增。引物中的條形碼（barcode）為 7 堿基序列編碼標(biāo)簽，每一個(gè)樣品采用特異性的條形碼對(duì)后續(xù)不同樣品間的測(cè)序序列行區(qū)分分類。具體的 PCR 體系及溫度程序詳見上海海生工生物工程股份司官網(wǎng)高通量測(cè)序服務(wù)詳細(xì)說明（http://www.sangon.com/services_ngs.htm

本文編號(hào)：2787611