【摘要】：石油污染對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害日益嚴(yán)重。物理化學(xué)方法治理石油污染雖然有效,但是成本高、甚至有次生污染的風(fēng)險(xiǎn)。微生物修復(fù)技術(shù)可有效去除石油污染,具有代謝終產(chǎn)物無(wú)毒性,操作簡(jiǎn)單,價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì),但存在降解速度慢、受環(huán)境因素如溫度、pH值等影響大、修復(fù)菌株潛在的生態(tài)危害等局限性。因此,篩選或者人工構(gòu)建降解能力強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)性?xún)?yōu)越、可控且無(wú)環(huán)境生態(tài)危害的工程菌株將極大地促進(jìn)微生物生態(tài)修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用。篩選石油降解菌株、確定石油降解的分子機(jī)制研究石油降解的分子機(jī)制,進(jìn)而通過(guò)基因改造強(qiáng)化石油降解能力和環(huán)境適應(yīng)能力已成為當(dāng)今生物修復(fù)石油污染研究的重要研究方向。本文從大慶油田污染土壤中分離獲得一株可高效利用石油烴類(lèi)物質(zhì)的菌株SJTD-1,從直鏈烷烴降解效能分析、全基因組序列比對(duì)與蛋白組學(xué)分析、烷烴氧化酶的鑒定及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制這幾方面進(jìn)行系統(tǒng)研究。以不同長(zhǎng)度直鏈烷烴為單一碳源培養(yǎng)菌株SJTD-1,生長(zhǎng)曲線顯示其在C16-C20烷烴中生長(zhǎng)最佳,并能在高達(dá)2 g/L的正十六烷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。氣相檢測(cè)結(jié)果顯示,該菌株在36小時(shí)內(nèi)可將500 mg/L的正十四烷,正十六烷與正十八烷全部分解,七天內(nèi)對(duì)2 g/L烷烴的分解率超過(guò)95%。以上結(jié)果說(shuō)明菌株SJTD-1能高效降解直鏈烷烴。經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株SJTD-1屬于銅綠假單胞菌,故將其命名為銅綠假單胞菌SJTD-1。利用Roche 454 FLX+及Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)SJTD-1全基因組進(jìn)行測(cè)序�；蚪M全長(zhǎng)6,074,058 bp,預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)5560個(gè)。全基因組序列比對(duì)分析顯示,菌株SJTD-1中含有至少5個(gè)烷烴氧化酶同源蛋白,其編碼基因?yàn)閮蓚�(gè)烷烴羥化酶基因alkB1(SJTD-1_4712),alkB2(SJTD-1_3623),兩個(gè)細(xì)胞色素P450基因(SJTD-1_5482和SJTD-1_4609),和一個(gè)almA-like黃素單加氧酶基因(SJTD-1_3206)。利用iTRAQ-based蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較以葡萄糖或正十八烷烴為單一碳源時(shí)SJTD-1全蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果顯示共有476個(gè)差異蛋白(占據(jù)基因組編碼蛋白總量的8.4%),涵蓋攝取、代謝到能量轉(zhuǎn)化烷烴底物的完整過(guò)程,以及分泌、環(huán)境壓力、調(diào)控等細(xì)胞進(jìn)程。特別的,在表達(dá)上調(diào)蛋白中發(fā)現(xiàn)了與乙醛酸循環(huán)、趨化性、VI型分泌系統(tǒng)相關(guān)的一系列蛋白,提示當(dāng)烷烴存在時(shí)菌體這些生理活動(dòng)增強(qiáng),為探索烷烴降解途徑、改造應(yīng)用型工程菌株提供了新的研究視角。另外,基因預(yù)測(cè)的AlkB2(SJTD-1_3623編碼)的表達(dá)量上調(diào)4.05倍,說(shuō)明AlkB2的表達(dá)受正十八烷烴強(qiáng)烈誘導(dǎo),提示該蛋白在長(zhǎng)鏈烷烴代謝中的重要作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)另一個(gè)與AlmA-like黃素單加氧酶有一定同源性的蛋白(SJTD-1_3636編碼)表達(dá)上調(diào)2.35倍,這是首次在假單胞菌中發(fā)現(xiàn)AlmA-like家族蛋白受長(zhǎng)鏈烷烴誘導(dǎo),為研究長(zhǎng)鏈烷烴代謝機(jī)制提供了重要的數(shù)據(jù)依據(jù)。通過(guò)基因敲除及RT-qPCR實(shí)驗(yàn)方法對(duì)預(yù)測(cè)的5個(gè)烷烴氧化酶進(jìn)行功能鑒定。RT-qPCR結(jié)果顯示,alkB1和alkB2均受到中短鏈烷烴(n?16)不同程度誘導(dǎo),且alkB2在長(zhǎng)鏈烷烴(n?18)培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)。將野生型菌株與各敲除菌生長(zhǎng)及降解效率對(duì)比分析得知,alkB1或alkB2缺失菌株與野生型比烷烴降解譜出現(xiàn)漂移,但生長(zhǎng)差異不十分明顯;而雙敲除菌在中短鏈烷烴培養(yǎng)基中幾乎不生長(zhǎng),提示中短鏈烷烴的氧化主要由兩個(gè)AlkB蛋白負(fù)責(zé),且兩者在底物譜上存在重疊。由SJTD-1_5482和SJTD-1_4609編碼的P450蛋白和SJTD-1_3206編碼的AlmA-like蛋白分別受到短鏈和長(zhǎng)鏈烷烴一定程度誘導(dǎo),但是生長(zhǎng)降解實(shí)驗(yàn)顯示它們并非主要的烷烴氧化酶。以上表明,除了AlkB2外,SJTD-1菌中仍存在未知的烷烴氧化酶參與長(zhǎng)鏈烷烴的降解過(guò)程。為闡明烷烴誘導(dǎo)烷烴羥化酶表達(dá)的分子機(jī)制,以alkB2基因上游序列為誘餌,親和純化DNA結(jié)合蛋白,顯示Gnt R(SJTD-1_3624)與該DNA親和性很高。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)證實(shí)該GntR蛋白與alkB1和alkB2上游序列發(fā)生特異性結(jié)合,且與后者的結(jié)合十分緊密,而直鏈烷烴可抑制蛋白與DNA的結(jié)合。DNase I足跡實(shí)驗(yàn)確定了GntR的結(jié)合位點(diǎn)位于alkB2啟動(dòng)子上游30 bp處類(lèi)回文結(jié)構(gòu)序列5‘-att-GT-cag-AC-aat-3‘�；蚯贸c生長(zhǎng)降解分析進(jìn)一步證實(shí)該GntR蛋白以負(fù)調(diào)控模式直接調(diào)控alkB2的轉(zhuǎn)錄。據(jù)我們所知,至今尚無(wú)文獻(xiàn)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子GntR直接參與烷烴降解調(diào)控的作用。綜上所述,本論文對(duì)這株石油高效降解菌SJTD-1的降解性能、降解關(guān)鍵基因與調(diào)控分子機(jī)制進(jìn)行了深入且詳盡的研究,為其他烷烴降解菌株的機(jī)制研究與分子改造奠定了基礎(chǔ),必將推進(jìn)相關(guān)機(jī)制研究與實(shí)際應(yīng)用的進(jìn)程。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：X172

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2752359