【摘要】：細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)主要取決于細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期。細(xì)胞生長(zhǎng)主要是細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分的生物合成和核酸復(fù)制。細(xì)胞分裂包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的重建與分隔,以及遺傳物質(zhì)的分離。細(xì)胞周期則涉及到基因表達(dá)的時(shí)空特異性、蛋白定位和蛋白形式的調(diào)控。典型模式細(xì)菌Bacillus subtilis和Escherichia coli形態(tài)形成的分子機(jī)理已經(jīng)成為細(xì)胞學(xué)研究的熱點(diǎn)。但是,對(duì)于具有豐富多樣性的環(huán)境微生物的細(xì)胞形態(tài)形成規(guī)律、分子機(jī)制以及對(duì)應(yīng)的生理功能,仍有待研究。本文研究一株從多溴聯(lián)苯醚污染的河流底泥中富集分離到的、具有獨(dú)特絲狀-桿狀細(xì)胞形態(tài)變化周期的芽胞細(xì)菌(編號(hào)GY32),系統(tǒng)開(kāi)展了該菌對(duì)十溴聯(lián)苯醚(BDE209)的生物轉(zhuǎn)化作用、分類鑒定、細(xì)胞周期模型構(gòu)建、基因組學(xué)、比較基因組學(xué)以及特殊細(xì)胞形態(tài)變化的轉(zhuǎn)錄組學(xué)等研究,主要得出了如下結(jié)果:菌株GY32的生物修復(fù)潛力研究證實(shí)其具有吸附和轉(zhuǎn)化十溴聯(lián)苯醚(BDE209)的能力。菌株GY32活細(xì)胞和死菌體的吸附能力測(cè)定證實(shí)兩種情況吸附BDE209的量分別為18.43和13.05μg L-1。比較好氧、厭氧以及兼性厭氧條件下一個(gè)月內(nèi)該菌株對(duì)BDE209的轉(zhuǎn)化率,結(jié)果顯示:在初始濃度為0.6μmol L-1時(shí),該菌在厭氧和兼性厭氧條件下的BDE209去除率分別為31.7%和56.9%,而好氧體系中未見(jiàn)明顯的BDE209減量。本研究為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)兼性厭氧條件下菌株GY32對(duì)BDE209污染修復(fù)的應(yīng)用潛能提供了參考。菌株GY32的分類學(xué)研究確定其為賴氨酸芽胞桿菌屬(Lysinibacillus)的新種。形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)、化學(xué)指標(biāo)以及分子鑒定等多相分類研究結(jié)果顯示,菌株GY32具有與同屬菌種相似的一般生理生化特征,如生長(zhǎng)條件、V-P試驗(yàn)、細(xì)胞壁氨基酸類型、脂肪酸組成、醌型等,但是具有不同于屬內(nèi)其他菌種的特殊細(xì)胞形態(tài)變化周期、碳源利用譜、硝酸鹽還原陽(yáng)性及氧化酶測(cè)定陰性等特征,與屬內(nèi)近緣菌種的(G+C)mol%差異約為5%,DNA-DNA雜交率為52.1%。上述差異特征顯示該菌為L(zhǎng)ysinibacillus屬的一個(gè)新種,定名為變形賴氨酸芽胞桿菌(Lysinibacillus varians)。菌株GY32分類地位的確定不僅豐富了Lysinibacillus屬的組成,還為進(jìn)一步開(kāi)展此類環(huán)境微生物的其他研究,如潛在的生理功能和特定表型的分子基礎(chǔ)提供了參考。基于菌株GY32的形態(tài)學(xué)研究確定了絲狀-桿狀細(xì)胞形態(tài)的變化過(guò)程并構(gòu)建了此類菌株的細(xì)胞周期模型。本研究通過(guò)純芽胞收集、調(diào)節(jié)培養(yǎng)物稀釋倍數(shù)、摸索芽胞萌發(fā)條件,結(jié)合單個(gè)細(xì)胞發(fā)育實(shí)時(shí)在線觀察技術(shù),記錄了從芽胞膨脹萌發(fā)到細(xì)胞長(zhǎng)成絲狀再到分裂成桿狀直至再次形成芽胞的完整過(guò)程。芽胞在30℃條件下孵育2 h后,從芽胞萌發(fā)到再次形成芽胞的約33 h的細(xì)胞周期大致分為七步:(i)芽胞歷時(shí)約4.5 h膨大、出芽;(ii)芽在約2.0 h內(nèi)生長(zhǎng)為桿狀細(xì)胞(10μm)并脫離芽胞外殼;(iii)桿狀細(xì)胞在約1.5 h內(nèi),不發(fā)生細(xì)胞分裂而是快速生長(zhǎng)成絲狀細(xì)胞(~466.1μm);(iv)絲狀細(xì)胞開(kāi)始不對(duì)稱二分裂。母細(xì)胞與子細(xì)胞同時(shí)繼續(xù)生長(zhǎng),體系中細(xì)胞形態(tài)維持在大于10μm的絲狀,這個(gè)過(guò)程約3.0 h;(v)之后的約5.0 h內(nèi),絲狀細(xì)胞生長(zhǎng)到約原始長(zhǎng)度的2倍時(shí),就不對(duì)稱地二分裂,體系中絲狀和少量新分裂出的桿狀細(xì)胞共存。部分從芽胞萌發(fā)開(kāi)始一直未分裂的絲狀細(xì)胞開(kāi)始自溶;(vi)桿狀細(xì)胞比例越來(lái)越高,約12 h之后以長(zhǎng)度為5.0~10.0μm的桿狀細(xì)胞為主;(vii)約5.0 h后,體系內(nèi)全為桿狀細(xì)胞,并且開(kāi)始形成內(nèi)生芽胞。菌株GY32代表了不同于常規(guī)桿菌和球菌的新型的細(xì)胞形態(tài)變化周期,相應(yīng)的模型為進(jìn)一步開(kāi)展這類細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)形成分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。菌株GY32的基因組學(xué)研究確定了與該菌細(xì)胞形態(tài)形成相關(guān)的基因。通過(guò)全基因組序列測(cè)定,發(fā)現(xiàn)菌株GY32基因組由一個(gè)環(huán)狀染色體構(gòu)成�；蜃⑨尳Y(jié)果顯示該基因組中存在的雙組份系統(tǒng)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子及Sigma因子等起調(diào)節(jié)作用的基因是特定表型表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ);基因組中存在的細(xì)胞分裂相關(guān)基因與已知基因的同源性很高,但是其中同源基因的拷貝數(shù)有差異;基因組中具有不同于近緣菌種的細(xì)胞隔膜合成基因;移動(dòng)遺傳元件為該基因組引入了新的細(xì)胞壁合成基因。這些直接與細(xì)胞分裂和細(xì)胞調(diào)控相關(guān)的基因是Lysinibacillus varians GY32形態(tài)變化的遺傳基礎(chǔ)。比較基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析分別提供了GY32特有的細(xì)胞形態(tài)形成相關(guān)基因以及絲狀向桿狀細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變時(shí)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異的證據(jù)。菌株GY32中1300個(gè)與參比基因組同源性低的基因分別與轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳遞機(jī)制、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/細(xì)胞包被形成、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等方面的功能相關(guān)。其中與細(xì)胞分裂位點(diǎn)選擇相關(guān)的fts L、div IC、ded D、與分裂體錨定細(xì)胞膜相關(guān)的sep F、與染色體復(fù)制和分離相關(guān)的par A、par B、與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜合成相關(guān)的cwl K、pbp2B、maf B-like、fts E、fts X在菌株GY32的絲狀和桿狀兩種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平具有顯著差異,上述基因表達(dá)上調(diào)是細(xì)胞分裂加劇的分子基礎(chǔ)。而fts Z轉(zhuǎn)錄水平未見(jiàn)顯著差異則表明在兩種細(xì)胞形態(tài)下分裂體的關(guān)鍵骨架(Fts Z多聚體)組裝未受影響。核酸染色和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相結(jié)合顯示絲狀細(xì)胞形態(tài)中分裂位點(diǎn)能順利定位,分裂體骨架也可以正常組裝,但是由于sep F表達(dá)量低,Fts Z多聚體未能錨定到細(xì)胞膜,不能實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步細(xì)胞分裂。本論文的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)并確立了一個(gè)具有特殊絲狀-桿狀細(xì)胞形態(tài)變化周期的賴氨酸芽胞桿菌新種,構(gòu)建了此類菌的細(xì)胞周期模型,明確了該菌基因組中細(xì)胞形態(tài)形成相關(guān)基因的組成和特異的目標(biāo)基因的表達(dá)情況。本研究的結(jié)果初步證實(shí)在Lysinibacillus varians GY32從芽胞萌發(fā)至形成絲狀過(guò)程中,由于分裂體骨架未能錨定到細(xì)胞膜并提供細(xì)胞內(nèi)縊的力,導(dǎo)致細(xì)胞不分裂而是持續(xù)伸長(zhǎng)。而起錨定作用的sep F的表達(dá)上調(diào),配合相應(yīng)細(xì)胞隔膜形成基因的上調(diào)表達(dá),直接引起了細(xì)胞形態(tài)由絲狀向桿狀變化。顯然,確定此類菌細(xì)胞形態(tài)形成的分子機(jī)制細(xì)節(jié)還有很長(zhǎng)的路要走,但現(xiàn)有研究提供了初步的實(shí)驗(yàn)證據(jù),為進(jìn)一步開(kāi)展細(xì)胞分裂活動(dòng)的抑制和解抑制、細(xì)胞周期的調(diào)控、以及開(kāi)發(fā)菌株GY32對(duì)BDE209的降解功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：X172

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2751243