【摘要】：環(huán)境污染,特別是水體污染是目前嚴(yán)重危害人類的危機(jī)之一,其中重金屬污染更為突出。隨著對(duì)環(huán)境重金屬污染的危害、生物耐受重金屬污染的細(xì)胞及分子機(jī)理、環(huán)境重金屬污染的生物修復(fù)方面的深入研究發(fā)現(xiàn),金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)在重金屬解毒及環(huán)境污染監(jiān)測(cè)和生物修復(fù)中具有極為重要的作用。MT是一類廣泛存在于生物界,分子量較低(6～7 kDa),富含半胱氨酸,缺少芳香族氨基酸和組氨酸,且能與多種重金屬結(jié)合的熱穩(wěn)定胞內(nèi)蛋白質(zhì)。大量研究已經(jīng)證實(shí),MT具有保持體內(nèi)必需金屬元素平衡和重金屬解毒的雙重機(jī)制,同時(shí)在清除自由基、抵抗氧化壓力,以及參與激素和發(fā)育過(guò)程調(diào)節(jié)等方面都具有重要作用。河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)由海洋蟹類多元進(jìn)化而來(lái),隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)中的一個(gè)特殊分支,廣泛存在于我國(guó)山西省和河南省。作為生活于水體基底層的生物,河南華溪蟹直接面對(duì)沉積在水體的金屬離子,其MT的作用更為凸顯。本課題組在前期研究工作中,系統(tǒng)研究了河南華溪蟹主要組織MT表達(dá)以及與重金屬蓄積的關(guān)系,并完成了鎘誘導(dǎo)河南華溪蟹MT cDNA全長(zhǎng)序列的克隆。為深入研究河南華溪蟹MT的理化特性和生物學(xué)功能,探究其在重金屬脅迫中的解毒機(jī)制,分析MT在重金屬污染生物修復(fù)和重金屬環(huán)境污染監(jiān)控及保護(hù)中應(yīng)用的可能性,本學(xué)位論文完成了以下四部分的研究工作。1、河南華溪蟹金屬硫蛋白的表達(dá)及其抗重金屬脅迫能力研究利用SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)了河南華溪蟹MT,經(jīng)Ni離子金屬螯合柱分離純化后,對(duì)其金屬結(jié)合及清除自由基能力進(jìn)行了檢測(cè)；利用純化的融合蛋白SUMO-MT免疫BALB/c、鼠制備抗血清,間接ELISA檢測(cè)該抗血清的效價(jià),Western blot和免疫組化染色檢測(cè)其特異性；采用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)MT的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,構(gòu)建了兩種突變體SUMO-MTt1 (N2C)和SUMO-MTt2 (S36C),分別測(cè)定了MT及其突變體對(duì)Cu、Cd、Zn三種金屬的抗性及蓄積能力。結(jié)果表明,河南華溪蟹MT以可溶形式獲得表達(dá),經(jīng)金屬螯合層析純化后分析其仍具有金屬結(jié)合特性和清除羥自由基的生物學(xué)功能；免疫BALB/c小鼠后獲得特異性的抗MT抗血清,該抗血清具有較高的效價(jià)和良好的特異性,可識(shí)別組織MT,用于免疫組化分析；成功構(gòu)建了SUMO-MTtl (N2C)和SUMO-MTt2 (S36C)兩種突變體,且較空菌體,三種轉(zhuǎn)MT或突變體工程菌對(duì)Zn2+、Cd2+和Cu2+三種重金屬的抗性及蓄積能力均有顯著提高,金屬離子在重組工程菌體內(nèi)的積累和抗性基本呈現(xiàn)如下順序：SUMO-MTt1 SUMO-MTt2 SUMO-MT;針對(duì)同一價(jià)態(tài)、不同類型的金屬離子,三種工程菌對(duì)Cd2+的積累最大,而Zn2+和Cu2+的吸收能力相近。2、河南華溪蟹金屬硫蛋白單克隆抗體的制備與鑒定以重組融合蛋白SUMO-MT為免疫抗原、切割融合標(biāo)簽后MT為檢測(cè)抗原,利用雜交瘤技術(shù)建立抗河南華溪蟹MTmAb雜交瘤細(xì)胞株。采用間接ELISA測(cè)定mAb腹水效價(jià),Western blot法、Dot-ELISA分析mAb的特異性,疊加ELISA法鑒定了兩種單克隆抗體的抗原結(jié)合表位。結(jié)果顯示,成功建立了2株穩(wěn)定分泌抗MT蛋白的單克隆抗體(mAb)雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為mAb-MT2和mAb-MT3,均屬于IgG1亞類。腹水效價(jià)分別為1：5×105、1：1×106,Western blot和Dot-ELISA結(jié)果證實(shí)兩株mAb均能特異性識(shí)別重組MT和內(nèi)源性組織MT,疊加ELISA法測(cè)定兩種mAb具有同一的抗原識(shí)別位點(diǎn)。高特異性河南華溪蟹MTmAb的制備、鑒定及其免疫學(xué)特性分析,為深入研究MT的生物學(xué)功能以及建立快速、敏感的新型免疫學(xué)檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。3、河南華溪蟹金屬硫蛋白的分泌表達(dá)與免疫親和純化及金屬結(jié)合能力采用基因重組技術(shù),將河南華溪MT基因亞克隆至phoA分泌型原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3),通過(guò)低磷酸鹽誘導(dǎo)重組非融合型MT表達(dá)；利用單克隆抗體]mAb-MT2免疫親和層析分離純化重組MT蛋白,紫外光譜掃描分析、SDS-PAGE及Western blot鑒定；測(cè)定重組MT的自由基清除能力,分析其體內(nèi)金屬親和特性；MT經(jīng)體外重構(gòu)后,紫外掃描不同金屬/MT復(fù)合物,分析其體外金屬結(jié)合偏好。結(jié)果表明,利用phoA分泌表達(dá)系統(tǒng),成功實(shí)現(xiàn)了非融合MT的重組可溶表達(dá),紫外光譜掃描和Western blot均證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物的正確性,SDS-PAGE分析其純度較高,主要以單體和二聚體的形式存在,其分子量分別約為7.5 kD和15 kD；非融合MT具有與SUMO-MT一致的自由基清除能力,在Zn、Cu、Cd三種不同金屬離子脅迫下,MT蛋白表現(xiàn)出不同的金屬親和力順序：ZnCuCd;經(jīng)體外重構(gòu)后,紫外光譜掃描結(jié)果顯示均形成單一金屬/MT復(fù)合物,進(jìn)一步分析顯示,河南華溪蟹MT與Zn、Cu、Cd三種不同金屬離子幾乎具有一致的金屬結(jié)合能力,證實(shí)其屬于非金屬結(jié)合特異性MT而在體內(nèi)具有多種生理功能。本研究利用phoA分泌表達(dá)系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了河南華溪蟹非融合型MT的可溶表達(dá),并利用MT單克隆抗體建立了高效、簡(jiǎn)便的免疫親和純化方法,分析了MT體內(nèi)、體外金屬結(jié)合特性,為深入研究河南華溪蟹MT在體內(nèi)的生理功能奠定了理論基礎(chǔ)。4、河南華溪蟹金屬硫蛋白酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法的建立選擇具有良好免疫原性的河南華溪蟹重組SUMO-MT蛋白作為免疫抗原,免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,經(jīng)ELISA和Western blot檢測(cè)其特異性；以重組非融合河南華溪蟹MT作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,利用河南華溪蟹MT單克隆抗體mAb-MT3作為捕獲抗體,以純化的兔多克隆抗體作為檢測(cè)抗體,通過(guò)棋盤(pán)滴定法確定最佳實(shí)驗(yàn)條件,建立了河南華溪蟹MT雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果顯示,捕獲抗體最佳稀釋倍數(shù)為1：12800,檢測(cè)抗體最佳稀釋倍數(shù)為1：6400；標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0035x+0.0068(R2=0.9981),其中x為MT蛋白濃度、y為OD450值,工作范圍為40-800 ng/mL;該方法的檢測(cè)靈敏度為20.0 ng/mL,批內(nèi)和批間差分別為4.22%和4.09%,具有良好的重復(fù)性。準(zhǔn)確、特異、靈敏的ELISA檢測(cè)方法的建立,為河南華溪蟹MT的深入研究及其在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：X835;X503.22

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2739408