【摘要】： 近年來(lái),環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)對(duì)人類(lèi)和野生動(dòng)物健康的不良影響已引起學(xué)術(shù)界和政府的廣泛關(guān)注。EDCs是能干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)從而影響生物生殖的一大類(lèi)化合物。17α-炔雌醇(17α-ethynylestradiol,EE_2)是一種常見(jiàn)的EDCs,它是合成避孕藥的一種常用成分,通過(guò)污水處理系統(tǒng)進(jìn)入水環(huán)境。在污水處理系統(tǒng)排出的水中,EE_2的濃度可達(dá)7.2—42 ng/1。約5.7%的美國(guó)河流中EE_2含量超過(guò)5 ng/l。由于EE_2的半衰期長(zhǎng)及生物富集作用,魚(yú)體內(nèi)EE_2的含量可比自然環(huán)境中高332倍,而且EE_2的雌激素作用在生物體內(nèi)為雌二醇(E_2)和雌激素酮(E_1)的10—50倍。魚(yú)類(lèi)暴露于EE_2污染的水環(huán)境中可引起卵黃生成素(Vitellogenin,Vtg)表達(dá),性分化異常及生殖功能受損。鑒于EE_2的強(qiáng)效作用以及在環(huán)境中的廣泛分布,EE_2可導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)不育甚至影響魚(yú)類(lèi)的種群繁殖。 為了解EE_2暴露對(duì)斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育以及生殖系統(tǒng)的影響,我們將斑馬魚(yú)分成溶劑對(duì)照、0.4 ng/L、2 ng/L和10 ng/L EE_2處理組,從出生后2天(2 days post hatch,2 dph)暴露至90 dph,之后將所有斑馬魚(yú)在不含EE_2的清水中恢復(fù)至180 dph。90 dph時(shí),2 ng/L和10 ng/L EE_2處理組斑馬魚(yú)的死亡率及心包水腫率均顯著高于對(duì)照組,10 ng/L EE_2組的平均體重和體長(zhǎng)亦顯著低于對(duì)照組。這些結(jié)果顯示高于10 ng/L的EE_2暴露會(huì)有較強(qiáng)的非特異毒性作用。我們也利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)檢測(cè)了暴露于EE_2的斑馬魚(yú)出生后第2天至出生后28天Vtg基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示10 ng/l EE_2暴露21天后(21 day post hactch,21 dph)便可誘導(dǎo)Vtg表達(dá)。用我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的對(duì)雌激素敏感的Vtg-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)做相同的暴露處理進(jìn)一步驗(yàn)證了RT-PCR的結(jié)果,表明Vtg可作為檢測(cè)環(huán)境雌激素(Environmentalestrogens,EEs)污染水環(huán)境的早期敏感的生物標(biāo)志物。 在EE_2暴露影響斑馬魚(yú)生殖功能的機(jī)理研究中,EE_2干擾斑馬魚(yú)性腺發(fā)育分化從而損害生殖功能是一個(gè)重要的原因。90 dph時(shí)的性腺組織切片顯示EE_2暴露嚴(yán)重抑制處理組斑馬魚(yú)的正常性腺發(fā)育和分化,這些魚(yú)的性腺處于幼稚卵巢甚至完全未分化階段。將這批斑馬魚(yú)在清水中恢復(fù)試驗(yàn)3個(gè)月后,再次行性腺組織切片檢查。結(jié)果提示各組斑馬魚(yú)已恢復(fù)正常性別比例,然而EE_2處理組雄性斑馬魚(yú)的精巢明顯異常,表現(xiàn)為生精小管?chē)?yán)重畸形和精子數(shù)量減少。雌魚(yú)卵巢組織切片未發(fā)現(xiàn)明顯異常。 180 dph時(shí)的交配產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)顯示EE_2處理組斑馬魚(yú)的產(chǎn)卵數(shù)量及12 hpf卵存活率均較對(duì)照組顯著降低。為了研究EE_2對(duì)雌雄斑馬魚(yú)分別的生殖毒理作用,我們又采用了雌/雄置換交配的方法,分別研究了EE_2處理組雌雄兩性的生殖功能。結(jié)果顯示EE_2處理組雌雄魚(yú)生殖功能均嚴(yán)重受損,表現(xiàn)為雌魚(yú)產(chǎn)卵數(shù)量下降,卵存活率降低;進(jìn)一步通過(guò)精于計(jì)數(shù)及精液分析,證實(shí)處理組卵存活率下降的原因是雄魚(yú)的精液量下降所致。 一些EDCs如硫丹(endosulfan)和壬基酚(nonylphenol,NP)可干擾斑馬魚(yú)胚胎原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells,PGCs)的遷移和分布從而可能對(duì)斑馬魚(yú)的生殖產(chǎn)生不利影響。目前尚沒(méi)有關(guān)于EEs對(duì)斑馬魚(yú)PGC作用的報(bào)道。我們通過(guò)用綠色熒光蛋白標(biāo)記PGC以及整體原位雜交,研究了EE_2暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎PGC的遷移和分布的影響。結(jié)果顯示,10 ng/L和100 ng/L EE_2處理組斑馬魚(yú)PGC的遷移和分布與對(duì)照組無(wú)顯著差異。分析其原因可能和早期性腺組織對(duì)EE_2不敏感有關(guān)。我們?nèi)圆荒芘懦渌腅Es對(duì)PGC可能的不利影響。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：X174

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本文編號(hào)：2734105