【摘要】：3,5,6-三氯-2-吡啶醇(3,5,6-trichloro-2-pyridinol, TCP)是除草劑綠草定和殺蟲劑毒死蜱及甲基毒死蜱的主要降解產(chǎn)物,廣泛存在于環(huán)境中。在土壤中,由于TCP比毒死蜱吸附性差而穩(wěn)定性和水溶性強(qiáng),所以有著更強(qiáng)的滲透性。食入TCP對人體有危害,TCP尤其會對眼睛造成嚴(yán)重的損害,此外TCP對水生和陸生生態(tài)區(qū)有著低到中度的毒害作用,對生態(tài)系統(tǒng)影響較大。雖然通過物理和化學(xué)方法可降解TCP,但相比之下由于TCP微生物降解具有高效性,低成本,環(huán)境友好型等特點(diǎn),使其在TCP環(huán)境污染治理方面更具有潛力。到目前為止,有關(guān)TCP微生物降解報(bào)道較少,因此分離和豐富TCP降解菌種資源具有十分重要的意義,本研究通過富集培養(yǎng)的方法分離得到一株TCP降解菌T6,然后對其進(jìn)行了菌種鑒定及降解特性和降解機(jī)制研究。 從污水處理池中采得活性污泥樣品,通過富集培養(yǎng)的方法分離得到一株穩(wěn)定的3,5,6-三氯-2-吡啶醇(TCP)降解菌T6。菌株T6為一短桿狀的革蘭氏陰性菌,結(jié)合對菌株T6進(jìn)行的16S rRNA基因序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,將其初步鑒定為Ralstonia sp. strain T6。 Ralstonia sp. strain T6對TCP具有高效的降解速率,能夠在1h內(nèi)將10mg/LTCP完全降解,在12h內(nèi)將100mg/L TCP完全降解,在80h內(nèi)將700mg/L TCP完全降解。Ralstonia sp. strain T6降解TCP的最適pH值和最適溫度分別為8和30℃。K+對Ralstonia sp. strain T6降解TCP有促進(jìn)作用；Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+對TCP降解沒有明顯的影響；Zn2+、Co2+、Ni2+對TCP降解有明顯的抑制作用；Cu2+則完全抑制Ralstonia sp. strain T6對TCP的降解。利用硝酸銀滴定法,液相色譜——質(zhì)譜聯(lián)機(jī)等檢測手段將TCP降解過程中產(chǎn)生的綠色中間體初步鑒定為3,6-二羥基吡啶-2,5-二酮。 通過簡并引物從Ralstonia sp. strain T6的基因組中成功擴(kuò)增出利用FADH2的單加氧酶基因(tcpA)的部分序列,利用基因打靶技術(shù)將tcpA插入失活,突變菌株(T6-ΔtcpA)失去了降解TCP的能力但仍能夠降解綠色中間體3,6-二羥基吡啶-2,5-二酮。推測Ralstonia sp. strain T6中參與TCP降解起始的基因位于tcpA基因序列的上下游。利用SEFA PCR技術(shù)擴(kuò)增tcpA的側(cè)翼序列,克隆到一段由3個(gè)基因組成的tcp基因簇。將tcp基因簇中的3個(gè)ORF分別命名為基因tcpR,tcpX和tcpA,長度分別為972bp,552bp和1554bp,其中TcpR和TcpX分別與LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(LysR family transcriptional regulator)和黃素還原酶(flavin reductase)有著較高的一致性,黃素還原酶可將NAD(P)H中的H傳遞給FAD而生成FADH2。隨后通過對突變體T6-ΔtcpA中插入失活的基因tcpA進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了互補(bǔ)菌株T6-ΔtcpA-com恢復(fù)了對TCP的降解功能,說明菌株T6中的tcpA基因確實(shí)為TCP降解起始階段的關(guān)鍵基因,TcpA催化TCP生成綠色中間體3,6-二羥基吡啶-2,5-二酮。同時(shí)TcpA為依賴于FADH2的單加氧酶,因此推測在TcpA催化TCP降解過程中TcpX發(fā)揮著黃素還原酶的功能,為TcpA反應(yīng)提供所需的FADH2,而TcpR對降解起著調(diào)節(jié)作用。 通過對菌株T6進(jìn)行隨機(jī)插入失活突變子文庫構(gòu)建,成功篩選出4個(gè)突變子,在功能上都已不能降解綠色中間體3,6-二羥基吡啶-2,5-二酮。通過側(cè)翼序列擴(kuò)增,得到了一段長約5.9kb的片斷。經(jīng)過序列分析,認(rèn)為這一段序列中的4個(gè)基因組成了菌株T6中進(jìn)一步降解綠色中間體3,6-二羥基吡啶-2,5-二酮的thp基因簇。將thp基因簇中的4個(gè)ORF分別命名為基因thpR, thpI, thpJ和thpK,長度分別為900bp,717bp,879bp和1251bp。通過構(gòu)建異源重組表達(dá)載體和誘導(dǎo)表達(dá)的方法分別檢測ThpJ和ThpI的粗酶液活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ThpJ對綠色中間體3,6-二羥基吡啶-2,5-二酮有很好的降解活性,能將其完全降解并生成一種新的中間體5-氧基-2,4,5-三羰基正戊酸；而ThpI能將5-氨基-2,4,5-三羰基正戊酸進(jìn)一步進(jìn)行降解,可以看出ThpJ和ThpI能夠先后對TCP降解中間體3,6-二羥基吡啶-2,5-二酮進(jìn)行有效的降解。同時(shí)根據(jù)蛋白質(zhì)序列同源性分析,推測ThpR和ThpK分別在thp降解基因簇中起著調(diào)節(jié)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ堋?綜上所述,菌株T6中TCP降解相關(guān)基因簇tcp基因簇和thp基因簇能夠先后對TCP進(jìn)行有效降解,其中tcp基因簇主要負(fù)責(zé)TCP降解初始階段綠色中間體3,6--羥基吡啶-2,5-二酮的生成,thp基因簇能夠?qū)?,6-二羥基吡啶-2,5-二酮進(jìn)行進(jìn)一步的有效降解,從而實(shí)現(xiàn)菌株T6對TCP的徹底降解。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：X172

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2729382