發(fā)布時(shí)間：2020-06-22 12:30

【摘要】：二甲戊靈[N-(1-乙基丙基)-2,6-二硝基-3,4-二甲苯胺],屬于二硝基苯胺類除草劑,是世界上銷售量第三大的除草劑及銷售量最大的選擇性除草劑,廣泛應(yīng)用于防除旱田和菜田中的一年生禾本科雜草和某些一年生闊葉雜草。但二甲戊靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,在環(huán)境中殘留期較長(zhǎng),對(duì)水生生物及陸生無脊椎動(dòng)物高毒,且具有潛在致癌性。因此研究二甲戊靈在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化等行為,闡明二甲戊靈在環(huán)境中的降解過程和機(jī)制,對(duì)于評(píng)估二甲戊靈應(yīng)用后的環(huán)境行為、毒理和生態(tài)安全性具有重要意義。研究表明微生物降解代謝是環(huán)境中二甲戊靈消解的主要因素,近年來,已分離篩選到多株降解二甲戊靈的細(xì)菌和真菌,并鑒定了多個(gè)中間降解產(chǎn)物。但二甲戊靈微生物降解的代謝途徑全過程及參與其中的酶和基因至今還沒有得到闡明。同時(shí),分離篩選高效的二甲戊靈降解菌株可用于研發(fā)二甲戊靈殘留污染生物修復(fù)技術(shù),具有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。此外,除草劑降解/脫毒酶基因在抗除草劑轉(zhuǎn)基因工程領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,而我國(guó)目前還缺乏具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的性能優(yōu)良的除草劑降解/脫毒酶基因�？钩輨┺D(zhuǎn)基因工程可以極有效地控制農(nóng)田雜草,其中最為成功的是抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物,已經(jīng)大量種植。但長(zhǎng)期使用草甘膦帶來嚴(yán)重的雜草抗性問題,急需發(fā)掘其它除草劑降解/脫毒酶基因,為研發(fā)新的抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物提供基因資源。二甲戊靈是一種廣泛使用的殺草譜較廣的除草劑,可作為抗除草劑轉(zhuǎn)基因工程的靶標(biāo)除草劑,因此二甲戊靈降解/脫毒酶基因在構(gòu)建抗除草劑作物中具有很好的應(yīng)用前景。本論文利用微生物富集馴化技術(shù)從活性污泥中分離到一株高效的二甲戊靈降解菌株Y3,對(duì)該菌株進(jìn)行了分類鑒定,利用高效液相色譜(HPLC)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)技術(shù)對(duì)菌株Y3降解代謝二甲戊靈的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)了 2個(gè)新的代謝產(chǎn)物�？寺〉蕉孜祆`降解關(guān)鍵基因硝基還原酶基因pnr,研究了 PNR的酶學(xué)特性。本文從菌株、酶學(xué)和基因水平對(duì)二甲戊靈的微生物降解機(jī)制進(jìn)行了闡述。研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究二甲戊靈在環(huán)境中的降解規(guī)律和機(jī)制提供理論依據(jù),為研發(fā)二甲戊靈殘留污染土壤和水體生物修復(fù)技術(shù)提供高效降解菌株,為抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的構(gòu)建提供具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的性能優(yōu)良的降解基因。本研究主要研究結(jié)果如下:1二甲戊靈降解菌株的分離篩選與鑒定以二甲戊靈為底物,通過富集馴化技術(shù)從處理二甲戊靈生產(chǎn)廢水的活性污泥中分離純化得到一株二甲戊靈高效降解菌株,命名為Y3。菌株Y3能以二甲戊靈為唯一碳源和能源生長(zhǎng),在36 h內(nèi)能降解82%的100 mg/L二甲戊靈,60 h內(nèi)能降解100%的100 mg/L二甲戊靈。菌株Y3在LB平板上菌落形態(tài)呈乳白色,邊緣褶皺不規(guī)則,菌落表面較干燥,革蘭氏染色呈陽性,菌體桿狀、好氧、產(chǎn)芽孢和周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析表明菌株Y3與Bacillus屬的親緣關(guān)系最近,與Bacillus subtilis菌株聚成一個(gè)分支。菌株Y3的16S rRNA基因序列與Bacillussubtilis subsp.inaquosorum KCTC 13429T 的 16S rRNA 序列相似性達(dá)到 99.9%,與Bacillus subtilis subsp.subtilis NCIB 3610T 的相似性為 99.4%,與Bacillus subtilis subsp.spizizenii NRRL B-23049T的相似性為99.1%。DNA-DNA雜交結(jié)果表明菌株Y3和Bacillus subtilis KCTC 13429T雜交率為75.3%,高于70%這一種間的界定閾值。結(jié)合菌株Y3的菌落形態(tài)特征、生理生化特征、16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析和DNA-DNA雜交,將菌株Y3鑒定為 Bacillus subtilis。菌株Y3降解二甲戊靈的最適溫度為30℃,最適pH為7.5。菌株Y3能降解二硝基苯胺類除草劑其他三種主要品種仲丁靈、氨磺靈和氟樂靈,菌株Y3對(duì)二甲戊靈、仲丁靈和氨磺靈的降解速率沒有顯著差異,但對(duì)氟樂靈的降解速率顯著低于二甲戊靈。此外菌株Y3還能降解二苯醚除草劑乳氟禾草靈和乙羧氟草醚。2菌株Y3降解二甲戊靈的代謝產(chǎn)物鑒定和代謝途徑研究采用HPLC-MS/MS方法對(duì)菌株Y3降解二甲戊靈的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。HPLC檢測(cè)到3個(gè)保留時(shí)間分別為8.92 min、4.85 min和4.5 min的產(chǎn)物峰,其[M+H]+分別為m/z252.17、m/z266.15和m/z250.12,經(jīng)MS/MS分析將這三個(gè)產(chǎn)物分別鑒定為6-氨基二甲戊靈、5-氨基-2-甲基-3-亞硝基-4-(戊烷基-3-氨基)-苯甲酸和8-氨基-2-乙基-5-(羥甲基)-1,2-二氫喹喔啉-6-羧酸。根據(jù)代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果推測(cè)菌株Y3降解二甲戊靈的部分代謝途徑為:首先通過硝基還原作用將二甲戊靈轉(zhuǎn)化成6-氨基二甲戊靈,進(jìn)而又發(fā)生硝基還原作用和羧化作用生成5-氨基-2-甲基-3-亞硝基-4-(戊烷基-3氨基)-苯甲酸,隨后發(fā)生環(huán)化和羥基化作用得到8-氨基-2-乙基-5-(羥甲基)-1,2-二氫喹喔啉-6-羧酸。3菌株Y3中二甲戊靈硝基還原酶基因pnr的克隆與鑒定為克隆菌株Y3的二甲戊靈硝基還原酶基因pnr,首先通過硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-Sepharose fast flow陰離子交換層析、疏水層析和Sephadex G-75凝膠過濾層析等蛋白純化技術(shù)對(duì)菌株Y3的二甲戊靈硝基還原酶進(jìn)行了純化。經(jīng)四步純化后,二甲戊靈硝基還原酶的比酶活由起始的0.38 U/mg protein提高到了 18.5 U/mg protein,目標(biāo)蛋白濃縮了 48.7倍。純化得到的二甲戊靈硝基還原酶經(jīng)Native-PAGE電泳后割膠,利用MALDI-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)肽指紋圖譜分析,將獲得的肽段序列與菌株Y3基因組框架圖中注釋的蛋白氨基酸序列進(jìn)行匹配分析,結(jié)果找到一個(gè)注釋為硝基還原酶的 ORF(ORF03879)。將該 ORF 連入 pET29a(+)后導(dǎo)入Escherichia coli BL21(DE3)進(jìn)行蛋白異源表達(dá),產(chǎn)物通過親和層析純化。酶活測(cè)定結(jié)果表明純化的表達(dá)產(chǎn)物具有二甲戊靈硝基還原酶活性,比酶活為25.1 U/mg protein。UHPLC-MS/MS和1H NMR鑒定結(jié)果表明PNR催化了二甲戊靈芳環(huán)C-6硝基基團(tuán)的還原,生成產(chǎn)物6-氨基二甲戊靈,說明該ORF就是pnr。PNR由209個(gè)氨基酸組成,編碼基因630 bp,蛋白分子量約為23 kDa。對(duì)蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析,PNR與B.subtilis subsp.strain 168中的一個(gè)功能未鑒定報(bào)道的NAD(P)H依賴型硝基還原酶YdgI有100%的序列相似性。在催化功能已鑒定并公開報(bào)道的硝基還原酶中,PNR與來源于Lactobacillus plantarum WCFS1的硝基苯甲酸硝基還原酶PnbA氨基酸序列相似性最高(僅35%),PNR與來源于Synechocystis sp.的醌還原酶DrgA有31%的氨基酸序列相似性,與Vbrio fischeri的NAD(P)H-flavin氧化還原酶Frase Ⅰ氨基酸序列相似性達(dá)到29%,與Pseudomonas putida的NAD(P)H-依賴型的氧化還原酶PnrB的相似性為28%。蛋白氨基酸系列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析表明二甲戊靈硝基還原酶PNR是Ⅰ型硝基還原酶GroupB亞家族B1中的一員。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明pnr基因在菌株Y3中為組成型表達(dá)。4二甲戊靈硝基還原酶PNR的酶學(xué)特性研究PNR的最適反應(yīng)pH為7.0,最適反應(yīng)溫度為35℃;PNR在pH5.0或pH8.8,及溫度高于50℃時(shí)不穩(wěn)定。1.0mM的Li+、K+、Co~(2+)、Mn~(2+)和Ni~(2+)對(duì)酶活沒有顯著影響,1.0 mM的Mg~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)和Fe3+對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用,而1.0 mM的Cd~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Ag+和Zn~(2+)對(duì)酶活有一定的抑制作用。100.0mMEDTA對(duì)酶活沒有明顯影響,100.0 mM SDS對(duì)酶活有微弱的抑制作用。100.0 mM還原劑DTT能顯著促進(jìn)PNR的活性。PNR僅能催化二甲戊靈的芳環(huán)C-6位的硝基還原為氨基,不能催化芳環(huán)C-2位硝基的還原。此外,PNR還能連續(xù)催化仲丁靈、氨磺靈和氟樂靈的兩個(gè)芳環(huán)硝基基團(tuán)還原。PNR對(duì)二甲戊靈、仲丁靈、氨磺靈和氟樂靈的Vmax/Km分別為33.63、33.34、33.31 和 31.10。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：X172;X592
【圖文】：

叫叩樷／／７？的降解效率最高，在２０邋ｄ內(nèi)能完全降解１０邋ｍｇ／Ｌ二甲戊靈。Ｚ７！邋0＾７？0／７／／７？逡逑主要通過兩條途徑代謝轉(zhuǎn)化二甲戊靈：一是部分硝基還原生成６－氨基二甲戊靈（ＰＲ），逡逑二是通過Ｎ端脫烷基生成產(chǎn)物３，４－二甲基－２，６－二硝基苯胺（ＤＡ）（圖１－４）。／＞／ｃｉ／７如逡逑0ｎｒ＾Ｃａｖ也能有效降解二甲戊靈，降解率為７９％，生成的中間代謝產(chǎn)物是二甲戊靈逡逑９逡逑

靈的富集培養(yǎng)液。紫外－可見光掃描檢測(cè)發(fā)現(xiàn)含有土樣的處理組中的二甲戊靈含量明逡逑顯低于不添加土樣的ＣＫ組，２００？６００邋ｍｎ波長(zhǎng)范圍內(nèi)二甲戊靈的特征吸收峰明顯下降，逡逑說明二甲戊靈被大量降解了（圖２－１），土樣富集液中二甲戊靈被降解了邋４３邋ｍｇ／Ｌ。逡逑：．ｏｏｃ－邐？逡逑（１逡逑，魯一ＣＫ逡逑＾邋Ｉ邋．ＯＯＣ－邐１邐？逡逑０．５００－邋Ｖ邐＼邐－逡逑０．０００邐１邋＾逡逑２００．００邐３００邋００邐４００．ＪＫ）邐５００．００邋５５Ｕ逡逑ｎｍ逡逑圖２－１二甲戊靈降解富集液紫外－可見光掃描圖譜逡逑ＣＫ，二甲戊靈空白對(duì)照；處理，添加土樣的二甲戊靈富集液。逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋ＵＶ－ｖｉｓｉｂｌｅ邋ｌｉｇｈｔ邋ｓｃａｎ邋ｏｆ邋ｐｅｎｄｉｍｅｔｈａｌｉｎ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋ｃｕｌｔｕｒｅ．逡逑ＣＫ，邋ｂｌａｎｋ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｏｆ邋ｐｅｎｄｉｍｅｔｈａｌｉｎ；邋Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，邋ｐｅｎｄｉｍｅｔｈａｌｉｎ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ逡逑ａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｓｌｕｄｇｅ．逡逑將第四代富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，ｉ（ｒ４至ｉｃｒ７梯度稀釋液涂布于含］00邋ｍｇ／Ｌ二逡逑甲戊靈的ＭＳＭ平板上，３０°Ｃ培養(yǎng)２ｄ后，分離篩選得到７株菌株，將這７株菌株單逡逑菌落分別接種至２０邋ｍＬ邋ＬＢ液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，離心收集菌體，逡逑用新鮮的ＭＳＭ洗滌２次后重懸菌體，然后按１％邋（ｖ／ｖ）的接種量接種至含１００邋ｍｇ／Ｌ逡逑二甲戊靈的２０邋ｍＬ邋ＭＳＭ中

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2725678