【摘要】：量子點(diǎn)(Quantum Dots,QDs)是一種半導(dǎo)體納米晶體,通常由ⅡB-Ⅵ A族元素(如CdTe,CdSe等)或者ⅢA-ⅤA族元素(如InP,GaAs等)組成。QDs為球狀或半球狀、粒徑范圍為2nm-100nm之間。對比傳統(tǒng)的熒光材料,QDs具有熒光壽命長、光穩(wěn)定性好、具有窄而對稱的發(fā)射光譜、發(fā)射光譜可根據(jù)粒徑和組成連續(xù)可調(diào)、表面修飾后有更好地生物相容性等優(yōu)秀特點(diǎn),因而QDs在高靈敏度檢測、長時間動態(tài)觀測、多指標(biāo)檢測等方面都有優(yōu)異的表現(xiàn)。同時,QDs因其獨(dú)特的物理學(xué)效應(yīng)及優(yōu)異的光學(xué)特性,在單電子器件、太陽能電池、光電器件等方面被廣泛應(yīng)用。隨著QDs應(yīng)用科學(xué)的不斷發(fā)展,量子點(diǎn)開始更多的進(jìn)入人們的工作、生活,而人們接觸到QDs的機(jī)會也不斷增加,這也使得人們開始越來越多的關(guān)注QDs對于生命體以及環(huán)境的潛在危害。QDs的暴露會使機(jī)體產(chǎn)生過量的活性氧物質(zhì)從而導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原平衡被打破,造成DNA和蛋白質(zhì)的氧化損傷、生物膜損害,從而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或壞死,因此氧化損傷被認(rèn)為是多種損傷和疾病的一般機(jī)制。目前,QDs的暴露是否會引起實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平變化尚存在爭議;從分子水平上研究QDs與氧化應(yīng)激相關(guān)生物大分子相互作用機(jī)理的報道較少;目前并沒有對同一種生物學(xué)標(biāo)志物在不同研究層面或暴露途徑下(分子、細(xì)胞、動物)的相關(guān)性研究。因此,有必要從分子、細(xì)胞和動物水平闡明疏基丙酸包被的碲化鎘量子點(diǎn)(MPA-CdTe QDs)暴露所誘發(fā)的機(jī)體氧化應(yīng)激的相關(guān)毒性效應(yīng)與機(jī)理,并對比、結(jié)合三個層面上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果整體性的分析了 MPA-CdTe QDs在不同暴露途徑下產(chǎn)生不同效應(yīng)的原因。本文將主要圍繞MPA-CdTe QDs誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等毒性效應(yīng)變化這一重點(diǎn),以儀器分析為手段、以分子、細(xì)胞和動物毒理學(xué)為背景,從分子、細(xì)胞和動物水平分析MPA-CdTe QDs誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激的作用機(jī)理,從而揭示MPA-CdTe QDs暴露損害健康的微觀機(jī)制。主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:(1)為了闡明MPA-CdTeQDs在實(shí)驗(yàn)動物水平上的毒性效應(yīng),我們將QDs溶于水后配置成不同濃度的溶液,以飼喂的方式進(jìn)行小鼠暴露的MPA-CdTeQDs,孵育一段時間后取小鼠肝臟用于本部分實(shí)驗(yàn)。首先肝細(xì)胞石蠟切片的結(jié)果顯示,30天的QDs暴露后小鼠肝臟細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)并未發(fā)生明顯改變。然后我們?nèi)×孔狱c(diǎn)孵育120天后的小鼠肝臟,制成細(xì)胞懸液后測定肝細(xì)胞的細(xì)胞活性、活性氧物質(zhì)(ROS)水平和丙二醛(MDA)水平,來評價量子點(diǎn)暴露于小鼠后對其肝臟細(xì)胞的毒性效應(yīng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,通過飲水飼喂的方式將MPA-CdTe QDs暴露于小鼠體內(nèi)后,并未引起小鼠肝臟的細(xì)胞活性改變以及相應(yīng)氧化應(yīng)激指標(biāo)的改變。(2)我們以小鼠肝星狀細(xì)胞、肝臟細(xì)胞和腎臟細(xì)胞作為研究對象,在體外進(jìn)行QDs的孵育后,從細(xì)胞水平研究MPA-CdTe QDs在小鼠肝細(xì)胞和腎細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)的相關(guān)毒性效應(yīng)與機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MPA-CdT QDs的暴露使肝星狀產(chǎn)生了激活,細(xì)胞由靜止型變?yōu)榧せ钚?α-SMA和GFAP蛋白表達(dá)量增加,這說明MPA-CdTe QDs的暴露對細(xì)胞產(chǎn)生了外源刺激,使得肝星狀細(xì)胞的表現(xiàn)型發(fā)生了改變。另外,本文選取QDs暴露后常見的兩種靶器官-肝和腎作為研究對象,并在實(shí)驗(yàn)中引入了細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路(extracellular regulated protein kinases,ERK)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)凋亡因子的活化情況的檢測,來研究MPA-CdTe QDs暴露后誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡的效應(yīng)與機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MPA-CdTe QDs的暴露可導(dǎo)致小鼠原代肝細(xì)胞和腎細(xì)胞活力的顯著下降(對比空白組,當(dāng)實(shí)驗(yàn)組量子點(diǎn)濃度達(dá)到10×10-6 M后,肝細(xì)胞細(xì)胞活性由由94.9%降低到83.6%,對于腎細(xì)胞細(xì)胞活性由92.6%降低到64.1%)以及顯著的細(xì)胞凋亡情況(對比空白組,實(shí)驗(yàn)組量子點(diǎn)濃度達(dá)到10×10-6 M時,肝細(xì)胞細(xì)胞凋亡率由9.3%升高到41.6%,腎細(xì)胞細(xì)胞凋亡率由1 6.2%升高到69.7%)。相對于肝細(xì)胞,腎細(xì)胞的細(xì)胞活性變化以及凋亡情況對MPA-CdTe QDs的暴露都更加敏感,呈現(xiàn)于更為明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。通過凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞所占比例的統(tǒng)計結(jié)果分析,MPA-CdTeQDs引起的細(xì)胞死亡主要是通過細(xì)胞凋亡的方式。實(shí)驗(yàn)濃度下包被劑MPA的暴露并未引起肝細(xì)胞和腎細(xì)胞的活性降低,而相對于同濃度的Cd2+而言,MPA-CdTe QDs的暴露引起了腎細(xì)胞更為顯著的活性降低,這表明量子點(diǎn)引起的細(xì)胞毒性不僅僅是其釋放的Cd2+造成,MPA-CdTe QDs還會通過其他途徑引起細(xì)胞活性的降低,我們猜測QDs與其釋放的鎘離子對細(xì)胞造成了聯(lián)合毒性。MPA-CdTe QDs的暴露導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)ROS(如O2-·、H2O2等)的產(chǎn)生(對比空白組,實(shí)驗(yàn)組量子點(diǎn)濃度增加到10×10-6M時,肝細(xì)胞內(nèi)ROS含量由3.5%增加到52.0%,腎細(xì)胞內(nèi)ROS含量由6.5%增加到32.7%),在細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的作用下部分ROS被分解,而未被分解的ROS則激活了細(xì)胞的ERK信號通路(對比空白組,當(dāng)實(shí)驗(yàn)組量子點(diǎn)濃度達(dá)到10×10-6 M后,肝細(xì)胞內(nèi)ERK信號通路活化程度由1.5%升高到40.4%,腎細(xì)胞內(nèi)ERK信號通路活化程度由1.4%升高到11.2%),從而引起了細(xì)胞對于增殖、凋亡等生理過程的調(diào)控;同時,ROS的累積也造成了誘發(fā)凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行因子Caspases的活化(對比空白組,當(dāng)實(shí)驗(yàn)組量子點(diǎn)濃度達(dá)到10×10-6M后,肝細(xì)胞內(nèi)Caspase活化程度由0.92%升高到11.0%,腎細(xì)胞內(nèi)Caspase活化程度由4.0%升高到18.8%),啟動了細(xì)胞對于凋亡的調(diào)控蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致了Caspases靶蛋白的水解、細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化、膜蛋白及DNA的氧化損傷等生理過程,細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化,最終引發(fā)了細(xì)胞的凋亡。(3)我們以動物體內(nèi)兩種重要的抗氧化酶——過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)以及具有間接抗氧化作用的人絨毛膜促性腺激素和轉(zhuǎn)鐵蛋白為研究對象,從分子水平研究MPA-CdTe QDs與相關(guān)蛋白反應(yīng)后對其結(jié)構(gòu)及功能的影響,從而研究分子層面上MPA-CdTe QDs的毒性效應(yīng)機(jī)理。研究結(jié)果表明,MPA-CdTe QDs與CAT發(fā)生了相互作用,輕微改變了酶的微環(huán)境且使其疏水性略有增強(qiáng);同時,MPA-CdTe QDs改變了 CAT酶活性中心處Heme基團(tuán)附近的構(gòu)象,并改變了 CAT的二級結(jié)構(gòu),使其蛋白骨架變得松散,空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,這可能造成了酶活性中心口袋變大或接近蛋白質(zhì)外層空間,使CAT與其底物—H2O2的接觸面積或接觸機(jī)會增多,從而導(dǎo)致了過氧化氫酶活性的增強(qiáng)。另一方面,MPA-CdTe QDs與SOD發(fā)生了相互作用,輕微改變了酶的微環(huán)境且使其疏水性略有增強(qiáng);同時,MPA-CdTe QDs改變了 SOD的二級結(jié)構(gòu),使其蛋白骨架變得松散,空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,其酶活性中心附近結(jié)構(gòu)遭到破壞,SOD與其底物的接觸面積或接觸機(jī)會發(fā)生改變,因而造成了超氧化物歧化酶活性的變化。結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MPA-CdTe QDs在分子水平對兩種酶活性的影響與細(xì)胞水平造成的影響并不相同:MPA-CdTe QDs暴露后,肝細(xì)胞內(nèi)的CAT活性未產(chǎn)生明顯變化而SOD活性則呈現(xiàn)上升趨勢;腎細(xì)胞內(nèi)的CAT活性在量子點(diǎn)濃度達(dá)到5×10-6 M時呈現(xiàn)顯著上升,而SOD的活性則從3×10-6 M時開始便表現(xiàn)出明顯下降的趨勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明除了與酶分子直接作用影響其活性外,在細(xì)胞內(nèi)還有其他因素影響了兩種抗氧化酶的活性,細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的變化是一個復(fù)雜的生理過程。對于間接抗氧化蛋白,MPA-CdTe QDs雖然沒有影響hCG的極性,但MPA-CdTe QDs與hCG發(fā)生了相互作用,改變了 hCG的骨架和二級結(jié)構(gòu),使其蛋白骨架變得松散,空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,并造成其活性中心受到影響,這可能造成了hCG活性的降低。另外,MPA-CdTe QDs與TRF發(fā)生了相互作用,MPA-CdTe QDs與TRF的相互作用使得TRF的骨架結(jié)構(gòu)變得松散,二級結(jié)構(gòu)展開,內(nèi)部疏水區(qū)氨基酸殘基外翻到外部親水區(qū)域。MPA-CdTe QDs改變了 TRF芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境,使之趨于親水。最后,我們從細(xì)胞水平和分子水平上闡明了 MPA-CdTe QDs暴露誘發(fā)DNA損傷的機(jī)理。細(xì)胞結(jié)果表明,在量子點(diǎn)濃度較低時(1×10-6 M)細(xì)胞即開始出現(xiàn)DNA損傷(對比空白組,當(dāng)實(shí)驗(yàn)組量子點(diǎn)濃度達(dá)到10×10-6M后,肝細(xì)胞內(nèi)DNA損傷程度由4.7%升高到46.3%,腎細(xì)胞內(nèi)DNA損傷程度由27.5%升高到91.6%);在同濃度量子點(diǎn)暴露時,腎細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷程度要高于肝細(xì)胞。DNA損傷的結(jié)果,與MPA-CdTe QDs造成的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度的結(jié)果相一致,這也說明MPA-CdTe QDs的暴露導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量的升高,從而引起了細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),對細(xì)胞的DNA造成了氧化損傷。另外,抗氧化劑NAC的加入,明顯降低了肝細(xì)胞和腎細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷程度(對于量子點(diǎn)濃度達(dá)到10×10-6 M的實(shí)驗(yàn)組,加入NAC后肝細(xì)胞內(nèi)DNA損傷程度由46.3%降低到26.7,腎細(xì)胞內(nèi)DNA損傷程度由91.6%降低到40.3%),這也再次證明了 QDs誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS是造成DNA損傷的重要原因。此外,本章通過多種光譜學(xué)方法、ITC等方法研究了 MPA-CdTeQDs誘發(fā)DNA損傷的分子機(jī)理,研究表明MPA-CdTeQDs可自發(fā)與DNA進(jìn)行結(jié)合,其結(jié)合方式為通過疏水作用力結(jié)合到DNA的磷酸骨架上,從而改變了 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：X171.5
【圖文】：

１０分鐘后，將三口燒瓶移入已加熱到ｌ00°Ｃ的油浴鍋中進(jìn)行加熱回流處理，反應(yīng)逡逑不同時間即可獲得不同粒徑的ＭＰＡ－ＣｄＴｅ量子點(diǎn)。本文選取制備時間為９０分鐘，逡逑發(fā)射波長為５６８ｎｍ左右的量子點(diǎn)作為研宄對象（如圖２－１所示）。合成的量子點(diǎn)逡逑與等體積的異丙醇混合，吹打均勻后移至離心機(jī)，在８５００轉(zhuǎn)／分鐘的轉(zhuǎn)速下離心逡逑５分鐘。然后棄去上清液，置入真空干燥器內(nèi)放置過夜。得到干燥的量子點(diǎn)粉末逡逑后重新加入超純水分散后備用。逡逑４０００邋－邐0＊－逡逑Ａ逡逑？邐／邐＼邐Ｓ逡逑／邐＼邐５邐０．２－邐＼邐／、＼逡逑☆邋３０００－邐／邐｜逡逑１邋／邋＼邋�！澹苠义现姡姡苓姟�。－邐、邐邐逡逑．５邐／邐＼邐邐．邐￣￣■￣￣．—逡逑Ｓ邋２000－邐／邐４００邐＾Ｗａｖｅ－ｅｎ＾ｎ．邋？逡逑Ｉ邐／邐＼逡逑１邐Ｉ邋＼逡逑２邐１０００－逡逑－＝逡逑＾邋＼逡逑0邐邐—－NB邐．、？－…邋邐．邋逡逑■邋Ｉ邐１邐［邐１邋Ｉ邐＇邋Ｉ邐１邋Ｉ邐１邐１邐＇逡逑４５０邐５００邐５５０邐６００邐６５０邐７００邐７５０邐８００逡逑Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ／ｎｍ逡逑圖２－１實(shí)驗(yàn)所用ＭＰＡ－ＣｄＴｅ量子點(diǎn)的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜逡逑１２逡逑

ｍｍ邋Ｉ邋■逡逑圖２－２紫外燈照射下的ＭＰＡ－ＣｄＴｅ量子點(diǎn)（從左到右回流時間為６０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、卯ｍｉｎ）逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋ＭＰＡ－ＣｄＴｅ邋ＱＤｓ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎｇ邋ｕｎｄｅｒ邋ＵＶ逡逑圖２－２展示了不同合成時間的ＭＰＡ－ＣｄＴｅ量子點(diǎn)在紫外照射下的發(fā)光情況。逡逑我們可以發(fā)現(xiàn)不同的回流時間可以獲得不同顏色的量子點(diǎn)，因而可以通過控制回逡逑流時間來得到實(shí)驗(yàn)所需特定波長量子點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選取回流時間為９０ｍｉｎ的ＭＰＡ－逡逑ＣｄＴｅ量子點(diǎn)作為實(shí)驗(yàn)用量子點(diǎn)，通過測定其熒光發(fā)射光譜（激發(fā)波長２８０邋ｒｎｎ）逡逑可以發(fā)現(xiàn)，合成的ＭＰＡ－ＣｄＴｅ量子點(diǎn)具有對稱的熒光發(fā)射峰以及較小的半峰寬逡逑（圖２－１），這說明合成的量子點(diǎn)具有分布均一的粒徑。逡逑邐ｉ邐逡逑：邐Ｊ．逡逑＾邐ＩＩ逡逑１０邐Ｊｌｉ逡逑ｍｉｌ逡逑Ｄｉａｍｅｔｅｒ（ｎｍ）逡逑圖２－３合成量子點(diǎn)的粒徑表征。（ａ）高分辨率透射電鏡圖（ｂ）邋ＭＰＡ－ＣｄＴｅ量子點(diǎn)粒徑分布圖逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＭＰＡ－ＣｄＴｅ邋ＱＤｓ．邋（ａ）：邋ｔｙｐｉｃａｌ邋ＨＲＴＥＭ邋ｉｍａｇｅ；邋（ｂ）：邋ｐａｒｔｉｃｌｅ邋ｓｉｚｅ逡逑１３逡逑

本文編號：2721737