【摘要】：四溴雙酚A是全球消耗量最大和應用最廣泛的溴代阻燃劑之一,由于其持久性、生物蓄積性和生物毒性而受到廣泛關(guān)注。四溴雙酚A廣泛分布于各類環(huán)境介質(zhì)中,包括近海海水、沉積物和生物體等。目前,四溴雙酚A的生物降解研究主要集中在厭氧轉(zhuǎn)化,而好氧生物降解研究僅局限于陸源微生物,且降解機制研究不充分。迄今為止,尚未有海洋微生物好氧降解四溴雙酚A的研究報道。鑒于四溴雙酚A在進入?yún)捬醐h(huán)境前會長期暴露于好氧環(huán)境,并與易降解有機物共存,因此開展好氧共代謝生物降解研究對了解四溴雙酚A的海洋環(huán)境行為具有重要意義。本文針對上述科學問題,基于近海微生物菌群、海洋細菌和響應基因三個層面,對好氧共代謝降解四溴雙酚A功能微生物及其降解機制進行深入解析,取得了以下主要研究結(jié)果:首先開展了海洋菌群好氧共代謝降解四溴雙酚A研究。采用不同共代謝基質(zhì)富集了近海微生物菌群(即A-H體系),發(fā)現(xiàn)不同菌群均具有好氧降解四溴雙酚A能力,其中以牛肉膏和蛋白胨作為共代謝基質(zhì)的菌群(G和H體系)降解能力最強,7天后四溴雙酚A降解率均能達到60%左右。利用高通量測序技術(shù)對四溴雙酚A與不同共代謝基質(zhì)經(jīng)120天培養(yǎng)的海洋微生物菌群多樣性和結(jié)構(gòu)變化進行分析,發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、深海單胞菌屬(Thalassomonas)、超微細菌屬(Glaciecola)和伯克氏菌屬(Limnobacter)為優(yōu)勢菌屬,可能參與好氧共代謝降解四溴雙酚A。對H體系通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析對四溴雙酚A降解中間產(chǎn)物檢測,推測出海洋微生物好氧共代謝降解四溴雙酚A是通過脫溴和異丙基斷裂兩條途徑同時好氧降解�？疾炝撕Ｑ蠹毦醚豕泊x降解四溴雙酚A特性。從已富集培養(yǎng)的海洋混合菌群(H體系),分離篩選出2株好氧共代謝降解四溴雙酚A的純菌,基于16S rRNA基因序列鑒定,分別命名為Alte omonas acleodii strain GCW和Pseudoalteromonas sp.strain GCY。菌株GCW和GCY好氧共代謝降解四溴雙酚A(10 mg/L),降解過程符合準一級動力學反應,速率常數(shù)(k)分別為0.27和0.15 d-1,相應的半衰期(T1/2)分別為2.6和4.7天。通過功能菌生理生化特性考察,發(fā)現(xiàn)菌株在培養(yǎng)期間,隨著四溴雙酚A濃度的增加會刺激菌株分泌胞外聚合物來抵御有毒物質(zhì)對其毒害作用。菌株GCW和GCY共代謝培養(yǎng)在濃度為10 mg/L四溴雙酚A作用下,其脫氫酶活性分別提高了3.2和1.6倍,與此同時電子傳遞活性也均呈現(xiàn)明顯上升趨勢。通過四溴雙酚A降解活性物種定位,發(fā)現(xiàn)菌株GCW胞外和胞內(nèi)提取物中的活性物質(zhì)對四溴雙酚A降解發(fā)揮了主要作用,菌株GCY降解四溴雙酚A主要發(fā)生在細胞外,由胞外酶和非酶活性物質(zhì)構(gòu)成。分析了海洋假交替單胞菌好氧共代謝降解四溴雙酚A途徑。鑒于Pseudoalteromonas sp.strain GCY為兼性菌,其降解四溴雙酚A幾乎是由胞外活性物種導致,選擇菌株GCY作為代表性海洋菌株詳細分析其胞外降解過程。對胞外提取物中具有降解四溴雙酚A的活性物質(zhì)通過鐵絡(luò)合和還原實驗、活性氧自由基熒光探針檢測和電子順磁共振光譜檢測技術(shù),發(fā)現(xiàn)在菌株GCY胞外提取物中存在鐵載體、過氧化氫、超氧陰離子自由基和羥基自由基。其中,胞外分泌的非酶小分子活性物質(zhì)具有絡(luò)合和還原鐵的特性;胞外過氧化氫的來源是由于胞外分泌的氨基酸氧化酶催化分解L-氨基酸脫氨的過程所致;胞外超氧陰離子自由基的生成是由呼吸系統(tǒng)中膜相關(guān)的NAD(P)H氧化還原酶產(chǎn)生;胞外羥基自由基的產(chǎn)生由Fe(Ⅲ)、鐵載體、超氧自由基和過氧化氫導致。高分辨液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀分析降解中間產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)脫溴和異丙基斷裂為菌株GCY好氧共代謝降解四溴雙酚A的主要途徑�；诮到庵虚g產(chǎn)物三溴酚,推測出活性溴自由基參與四溴雙酚A降解過程。研究了海洋假交替單胞菌胞外降解四溴雙酚A機制。通過對菌株GCY基因組測序和功能基因注釋,在基因組中發(fā)現(xiàn)L-賴氨酸-ε氧化酶抗菌蛋白LodA(基因lodA)和Na+-轉(zhuǎn)位NADH:醌氧化還原酶(基因nqrA)等與胞外活性氧自由基形成相關(guān)的基因。利用反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(RT-qPCR)對上述蛋白相對應的基因lodA和nqrA進行定量表達分析,發(fā)現(xiàn)菌株GCY在有/無四溴雙酚A(10 mg/L)培養(yǎng)體系培養(yǎng)至穩(wěn)定期時,基因lodA分別上調(diào)61.0和93.4倍,基因nqrA分別上調(diào)1.7和2.1倍,證實了基因lodA和nqrA分別參與菌株胞外產(chǎn)過氧化氫和超氧自由基的過程。由所獲得的實驗結(jié)論及熱動力學角度分析推測出假交替單胞菌GCY可通過三個途徑胞外好氧降解四溴雙酚A:超氧自由基直接脫溴、Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)-鐵載體與過氧化氫產(chǎn)生的Fenton-like反應和鐵催化的Haber-Weiss反應。此外,在陸域微生物系統(tǒng)中也發(fā)現(xiàn)了相似的胞外降解機制。開展了陸域細菌(Pseudomonas sp.fz)好氧共代謝胞外降解TBBPA研究,推測出胞外寡肽螯合Fe(Ⅲ)還原成寡肽螯合Fe(Ⅱ)與過氧化氫驅(qū)動胞外源于生物的Fenton-like反應降解四溴雙酚A為陸域細菌fz胞外降解四溴雙酚A的機制。發(fā)現(xiàn)陸域菌株fz好氧共代謝降解四溴雙酚A過程發(fā)生了明顯膜損傷,隨著培養(yǎng)時間延長,膜損傷越嚴重。海洋菌株GCY膜完整性分析發(fā)現(xiàn)該菌株未受到明顯膜損傷可能的原因是通過胞外聚合物和胞內(nèi)過氧化氫酶共同應對胞外氧化壓力�；诤Ｑ蠹毦鶪CY與陸域細菌fz共代謝四溴雙酚A的胞外降解機制比較,發(fā)現(xiàn)鐵載體、培養(yǎng)體系pH變化、超氧陰離子自由基、溴離子來源及細胞膜完整性為海洋與陸域細菌好氧共代謝降解四溴雙酚A主要差異;海洋與陸域細菌好氧降解四溴雙酚A均為共代謝過程、主要發(fā)生在胞外、活性物質(zhì)(鐵載體和活性氧物種)通過Fenton-like降解四溴雙酚A為二者共性。綜上,本論文結(jié)果表明海洋細菌可好氧共代謝降解四溴雙酚A,發(fā)現(xiàn)了胞外共代謝降解的新機制,揭示了胞外活性氧物種對近海生態(tài)環(huán)境中四溴雙酚A環(huán)境歸趨的重要作用。該研究成果可為自然環(huán)境和人工修復系統(tǒng)中微生物降解四溴雙酚A及其它有機污染物提供新的啟示,同時為研發(fā)高效生物修復新工藝提供理論依據(jù)。
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：X172;X703
【圖文】：

在溴代阻燃劑中，四溴雙酸Ａ邋（ｔｅｔｒａｂｒｏｍｏｂｉｓｐｈｅｎｏｌ邋Ａ，邋ＴＢＢＰＡ）、多溴二苯醚逡逑（ｐｏｌｙｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ邋ｄｉｐｈｅｎｙｌ邋ｅｔｈｅｒｓ，ＰＢＤＥｓ）和六溴環(huán)十二燒（ｈｅｘａｂｒｏｍｏｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ，逡逑ＨＢＣＤ）是目前國內(nèi)外消耗量大的三種阻燃劑，結(jié)構(gòu)式如圖１．１所示，它們通常作為反逡逑應型或添加型用于多種聚合材料中［３］。其中，ＴＢＢＰＡ占據(jù)全球溴代阻燃劑銷售市場的逡逑６０％左右，同時也是產(chǎn)量最大和應用最廣泛的溴代阻燃劑之一［４］。ＴＢＢＰＡ被廣泛應用于逡逑環(huán)氧樹脂和丙稀腈－丁二�。揭蚁」簿畚铮ǎ幔悖颍欤铮睿椋簦颍椋欤邋澹猓酰簦幔洌椋澹睿邋澹螅簦颍澹睿澹粒拢樱┲�，這逡逑些聚合物常用于生活中的各類消費品，如電子和娛樂設(shè)備等。逡逑Ｈ３Ａｈ３邐Ｘ，１－１。邐＾邐ｉｒ逡逑ＴＢＢＰＡ邐ＰＢＤＥｓ邐ＨＢＣＤ逡逑圖１．１四溴雙酚Ａ、多溴二苯醚和六溴環(huán)十二烷的化學結(jié)構(gòu)式逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ＴＢＢＰＡ，邋ＰＢＤＥｓ，邋ａｎｄ邋ＨＢＣＤ逡逑ＴＢＢＰＡ學名為４，４’－異丙叉雙（２，６－二溴苯酚），外觀白色固體粉末，分子量為５４３．８，逡逑化學式為Ｃ１５Ｈ１２0２Ｂｒ４。在ｐＨ為中性條件下

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ邋ｆｌａｍｅ邋ｒｅｔａｒｄａｎｔｓ邋ｉｎ邋ｃｏａｓｔａｌ邋ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ１４５５逡逑（８）四溴雙酚Ａ在生物質(zhì)中的分布逡逑ＴＢＢＰＡ具有高親脂性，會通過多種途徑并最終富集在生物體內(nèi)。有報道發(fā)現(xiàn)，在逡逑采集的挪威鳥蛋樣本中ＴＢＢＰＡ含量為１３邋ｐｇ／ｇ邋ｄｗ，推測其來源于海鳥母體［４７］。Ｚａｃｓ等逡逑在拉脫維亞的野生動物馬鹿、野豬和駝鹿樣本組織中檢測出ＴＢＢＰＡ含量為０．５２－４．５４逡逑ｐｇ／ｇ邋ｗｗ，指出在上述動物肝臟組織中ＴＢＢＰＡ的含量要高于肌肉組織［４８］。此外，研宄逡逑者采集了中國上海不同區(qū)域的樹皮，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)ＴＢＢＰＡ在各區(qū)域樹皮中的平均濃度為逡逑２８０邋ｎｇ／ｇｌｗ［４９］。Ｙａｎｇ等在中國巢湖采集受重度污染工業(yè)區(qū)的魚類，結(jié)果顯示ＴＢＢＰＡ在逡逑魚體的腎臟、肝臟、肌肉和脂肪樣本中的含量分別在７５．２－１２６．４邋ｎｇ／ｇ邋ｄｗ、１６－３７．５邋ｎｇ／ｇ邋ｄｗ、逡逑６．３－４６．０邋ｎｇ／ｇ邋ｄｗ和１２－２１．９邋ｎｇ／ｇ邋ｄｗ之間，這一結(jié)果很可能與巢湖水體受ＴＢＢＰＡ污染密逡逑切相關(guān)［２９］。Ｔａｎｇ等報道廣東省清遠市某一池塘（電子垃圾設(shè)施旁）中鯪魚和烏鱧體內(nèi)逡逑ＴＢＢＰＡ的濃度分別為４．３和９．７邋ｎｇ／ｇ邋ｌｗ＿。逡逑Ｇｕ等在韓國某養(yǎng)殖區(qū)的雙貝殼（牡蠣和貽貝）中檢測到ＴＢＢＰＡ的濃度在ｎ．ｄ．－１５８逡逑ｎｇ／ｇ邋ｌｗ之間［３９］。Ｇｕｏ等檢測中國青島近海特有貝類ｔ節(jié)孔扇貝（Ｃ／ｚ／ａｗ＞＾／ａ／ｒｅｒ／）中逡逑ＴＢＢＰＡ的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＴＢＢＰＡ的濃度范８．５－２１．７５邋ｎ／＿。Ｌｏｅｚ

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本文編號：2719985