【摘要】：禾谷鐮刀菌是自然環(huán)境中小麥赤霉病的主要致病菌，在生長(zhǎng)和侵染作物過(guò)程中產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀烯醇毒素（DON），聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將DON定為“最危險(xiǎn)的自然發(fā)生食品污染物”。我國(guó)多次對(duì)小麥、玉米及相關(guān)制品的真菌毒素污染調(diào)查結(jié)果顯示，樣品DON毒素污染率較高。目前主要使用化學(xué)殺真菌劑如多菌靈等防治禾谷鐮刀菌的污染。大部分農(nóng)藥殘存在自然環(huán)境中，嚴(yán)重威脅生態(tài)環(huán)境安全、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全、人和動(dòng)物的生命安全。生物學(xué)防治是目前比較有應(yīng)用前景的控制病原真菌及其毒素污染的措施，同時(shí)能夠減少化學(xué)農(nóng)藥使用量、降低農(nóng)業(yè)面源污染。生物農(nóng)藥高效、安全、環(huán)境相容性好，具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。但是，關(guān)于微生物防治儲(chǔ)藏小麥DON毒素污染的報(bào)道較少。因此本課題對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的分離自花生果殼、種子及莢果際等處的細(xì)菌進(jìn)行篩選，以期獲得在儲(chǔ)藏環(huán)境條件下能夠抑制麥粒中禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)和毒素產(chǎn)生的細(xì)菌及其活性物質(zhì)，為開(kāi)發(fā)用于儲(chǔ)糧的新型生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。 本研究首先利用平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，初篩到44株對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲體生長(zhǎng)抑制率在40%以上的菌株。Tip culture實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)菌發(fā)酵上清液的鐮刀菌抑制活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果38株菌顯示90%以上的抑制率。禾谷鐮刀菌侵染麥粒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)菌發(fā)酵上清液對(duì)DON毒素產(chǎn)生的影響，在鐮刀菌侵染麥粒18天后，HPLC檢測(cè)毒素的相對(duì)含量，結(jié)果14株菌的抑毒率在50%以上，其中菌株WPS4-1和WPP9的活性最高，抑制率90%左右。對(duì)14株細(xì)菌進(jìn)行了形態(tài)、生理生化鑒定及16S RNA基因和gyrA基因分子鑒定，表明所有菌株均為芽孢桿菌屬，與解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens的親緣關(guān)系最近。 用不同的溫度（35°C、60°C和121°C）、不同pH（pH1.0、3.0、5.0、9.0、11.0和13.0）和3種蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K）對(duì)拮抗細(xì)菌的發(fā)酵上清液進(jìn)行處理，結(jié)果表明拮抗物質(zhì)對(duì)溫度和酸性條件具有較好的穩(wěn)定性，對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。為了初步判斷拮抗物質(zhì)的類(lèi)別，選擇了芽孢桿菌屬真菌拮抗物質(zhì)的基因相對(duì)應(yīng)的19對(duì)引物，對(duì)拮抗菌的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果14對(duì)引物獲得了陽(yáng)性擴(kuò)增，基因序列經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，與目的基因相似性在97~99%。因此判斷基因組中含有與通過(guò)核糖體途徑合成的羊毛硫類(lèi)抗菌物質(zhì)ericin和sublancin、以及通過(guò)非核糖體途徑合成的脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)伊枯草菌素家族iturins、表面活性素surfactin、芬薺素fengycin和桿菌溶素bacilysin等合成相關(guān)的基因。 分別使用硫酸銨沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、有機(jī)溶劑萃取和鹽酸沉淀等方法分離細(xì)菌發(fā)酵上清液中的禾谷鐮刀菌拮抗物質(zhì)。60%飽和度硫酸銨沉淀物對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制率為78.07±3.21%，乙醇沉淀物和丙酮沉淀物的抑制率僅為4.92±1.81%和9.61±1.04%，四種有機(jī)溶劑乙酸乙酯、正丁醇、苯和氯仿萃取物的抑制率分別為87.01±2.41%、78.11±5.97%、73.16±3.29%和46.17±4.42%，鹽酸沉淀的甲醇提取物的抑制率為100%。因此根據(jù)粗提物的禾谷鐮刀菌抑制活性，判斷鹽酸沉淀的方法分離效果最好。吸附實(shí)驗(yàn)表明，大孔樹(shù)脂D296R和D301R具有較高的色素吸附而較低的活性物質(zhì)吸附能力，適合細(xì)菌發(fā)酵上清液中色素雜質(zhì)的去除。去色素的上清液經(jīng)濃鹽酸沉淀（pH3.0）、甲醇抽提，獲得脂肽粗提物。去色素上清液與脂肽粗提物的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果表明，WPS4-1可以產(chǎn)生伊枯草菌素和表面活性素類(lèi)抗菌物質(zhì)。 對(duì)脂肽粗提物的抗禾谷鐮刀菌活性及機(jī)理進(jìn)行了探討。Tip culture實(shí)驗(yàn)獲得脂肽粗提物對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲體生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度IC50為8.51μg/mL，禾谷鐮刀菌侵染麥粒實(shí)驗(yàn)表明，脂肽粗提物可以延遲或抑制其孢子的萌發(fā)，減少毒素的產(chǎn)量。光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察表明抑制作用體現(xiàn)在抑制孢子萌發(fā)和使菌絲畸形破裂，而且隨脂肽濃度增加，抑制作用增強(qiáng)。脂肽粗提物處理的鐮刀菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率增加，提示菌絲細(xì)胞膜受到破壞。熒光定量PCR分析表明含120μg/mL脂肽粗提物的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的菌絲體，其Tri5基因的表達(dá)量明顯低于對(duì)照，說(shuō)明脂肽粗提物通過(guò)抑制DON合成基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)鐮刀菌產(chǎn)毒的抑制作用。 芽孢桿菌脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)的生物合成受發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的影響。采用單因素實(shí)驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定拮抗菌株發(fā)酵產(chǎn)脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)基組成為小米面13.7g/L、黃豆餅粉2.5g/L和硝酸鈉3.0g/L。用此培養(yǎng)基發(fā)酵獲得的上清液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制率為90.38±1.33%，明顯高于原培養(yǎng)基的抑制率79.25±0.87%。單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳發(fā)酵溫度為32°C，10L發(fā)酵罐脂肽產(chǎn)量最大的發(fā)酵時(shí)間為4天。 本研究獲得了多株對(duì)禾谷鐮刀菌及其DON毒素有較強(qiáng)抑制活性的細(xì)菌，提供了鑒定及分離脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)的方法，初步探索了脂肽發(fā)揮抗真菌作用的機(jī)理，為脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)防治儲(chǔ)糧真菌及其毒素污染的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：X56;X172
【圖文】：

不飽和酮基組成（圖 1-1），化學(xué)名稱(chēng)為 39 烯 8 酮（3, 7, 15  trihydroxy  12, 其中的的 12，13 環(huán)氧環(huán)是其表現(xiàn)毒也隨之降低。α，β-不飽和酮基致使其。

鐮刀菌屬單端孢霉烯族毒素生物合成途徑[22]

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 袁婷露;曹秀云;;禾谷鐮刀菌致病力和致病基因的研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年14期

2 劉振宇;柳韶華;趙春青;于月芹;;枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)對(duì)桑炭疽病菌的抑制作用[J];蠶業(yè)科學(xué);2005年04期

3 王曉云;于雅琴;俞瓊;;2005年中國(guó)居民膳食DON污染調(diào)查及暴露評(píng)估[J];長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2007年02期

4 張婷;楊杰;周金燕;譚紅;;大孔吸附樹(shù)脂分離提取發(fā)酵液中伊枯草菌素A的研究[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年08期

5 王標(biāo)詩(shī),劉慧霞,張吉,梁海歐;大孔樹(shù)脂對(duì)酒精廢液中色素物吸附特性的研究[J];現(xiàn)代食品科技;2005年01期

6 劉新瓊;小麥赤霉病菌毒素研究進(jìn)展[J];湖北植保;1997年03期

7 王裕中,J.D.米勒;中國(guó)小麥赤霉病菌優(yōu)勢(shì)種——禾谷鐮刀菌產(chǎn)毒素能力的研究[J];真菌學(xué)報(bào);1994年03期

8 謝紅旗;周春山;;香菇多糖脫色工藝研究[J];離子交換與吸附;2007年02期

9 黃現(xiàn)青;別小妹;呂鳳霞;陸兆新;楊淑晶;袁勇軍;;枯草芽孢桿菌fmbJ產(chǎn)脂肽抑制點(diǎn)青霉效果及其桃防腐試驗(yàn)[J];農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào);2008年01期

10 林東,徐慶,劉憶舟,魏軍明,瞿禮嘉,顧紅雅,陳章良;枯草芽孢桿菌SO113分泌蛋白的抑菌作用及抗菌蛋白的分離純化[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2001年01期

本文編號(hào)：2719523