【摘要】：啶蟲脒是一種高效、低毒、廣譜的氯代煙堿類殺蟲劑,屬于新煙堿類殺蟲劑。目前,新煙堿類殺蟲劑已成為世界第一大殺蟲劑,而啶蟲脒又是其中重要種類,被廣泛用于防治水稻、蔬菜、棉花、果樹和茶葉上的蚜蟲、薊馬、飛虱以及部分鱗翅目害蟲等。由于啶蟲脒的廣泛使用,并且其水溶性高,極易通過土壤進入地表水和地下水。此外,啶蟲脒對蜜蜂等的急性毒性以及在茶葉、棉花上的殘留均有報道。微生物參與的代謝是啶蟲脒在環(huán)境中消除的主要途徑。近年來,已有一些關(guān)于啶蟲脒微生物降解的報道,但其研究內(nèi)容多集中于降解菌株的分離和代謝途徑的研究,對于啶蟲脒降解基因研究較少,僅有一個腈水合酶的報道。此外,啶蟲脒污染環(huán)境生物修復(fù)過程中的分子生態(tài)學(xué)效應(yīng)未見報道。因此,分離篩選啶蟲脒降解微生物菌株資源、闡明啶蟲脒的微生物代謝途徑、克隆降解關(guān)鍵酶基因以及揭示啶蟲脒生物修復(fù)中的分子生態(tài)學(xué)效應(yīng),具有重要的理論意義和潛在應(yīng)用價值。在本論文的研究中,通過連續(xù)富集培養(yǎng)的方法,從生產(chǎn)啶蟲脒農(nóng)藥廠的活性污泥中分離篩選到一株能夠以啶蟲脒為唯一碳源生長的高效降解菌株P(guān)igmentiphagasp.D-2,該菌株可在72 h內(nèi)降解99%以上的50 mg.L-1啶蟲脒,其最適生長和降解溫度為37℃,最適生長和降解pH值為7。通過HPLC-MS和MS-MS方法研究了菌株D-2對啶蟲脒的代謝途徑,發(fā)現(xiàn)其存在兩個不同的起始步驟:啶蟲脒C-N鍵斷裂生成1-(6-氯吡啶基-3-甲基)-N-甲基甲胺(命名為IM1-4)和啶蟲脒直接脫氯、脫甲基生成N'-氰基-N-甲基-N-(3-吡啶基甲基)甲脒,后者為首次報道。降解啶蟲脒的關(guān)鍵酶蛋白(Acetamiprid amidase,Ama)通過硫酸銨分級沉淀、Q-Sepharose FF離子柱層析和Superdex-200凝膠層析3步純化流程獲得。肽指紋圖譜鑒定結(jié)合菌株基因組框架圖測序結(jié)果分析,確定編碼蛋白的ORF為orf05630,位于Scaffold26上。ORF分析顯示Ama由α和β兩個亞基組成,將編碼α亞基的基因命名為ama1,基因全長372bp,編碼123 aa,分子量為13.5 kDa;編碼β亞基的基因命名為ama2,基因全長2295 bp,編碼764 aa,分子量為84.2 kDa。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),Ama 的 α 和β亞基與Paracoccus aminophilus的N,N-dimethylformamidase 的α和β亞基具有最高的相似性(分別為35%和56%)。設(shè)計引物擴增編碼Ama兩個亞基的序列,構(gòu)建表達載體pET-29a-ama,轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)中異源表達,純化的重組酶Ama能夠?qū)⑧はx脒水解成IM1-4;Ama的最適酶反應(yīng)溫度為37-55℃;最適酶反應(yīng)pH值為7.5。加入0.1 mM的Al3+、Fe3+、Fe2+和Li+,對Ama的酶活力有一定的促進作用(提高了 8.2%～20.8%左右);0.1 mM的Cu2+能夠抑制61.4%的Ama酶活力;0.1 mM的Hg2+能夠抑制96.8%的Ama酶活力。在研究菌株D-2對不同土壤中不同濃度啶蟲脒的降解時,發(fā)現(xiàn)當(dāng)啶蟲脒濃度較低(50mg·kg-1干土)時,酸性土壤(pH5.45)中啶蟲脒在40d內(nèi)的自然降解率為30.2%,中性土壤(pH 6.75)和堿性土壤(pH 7.85)在15 d內(nèi)的自然降解率分別為39.6%和59.1%。當(dāng)啶蟲脒濃度較高(200mg·kg-1干土)時,酸性土壤中啶蟲脒在40d內(nèi)自然降解24.3%,中性土壤在15 d內(nèi)自然降解26.7%,堿性土壤在15 d內(nèi)自然降解48.1%。推測土壤中的土著微生物在啶蟲脒的降解過程中發(fā)揮作用,且堿性環(huán)境有利于啶蟲脒的自然降解。接種菌株D-2能夠促進啶蟲脒的降解。當(dāng)啶蟲脒濃度為50mg·kg-1干土?xí)r,接種菌株D-2可以使酸性土壤中啶蟲脒在40d的降解率達94.8%,中性土壤中的啶蟲脒在15d的降解率為97.5%,堿性土壤中啶蟲脒在15d的的降解率為91.2%。當(dāng)啶蟲脒濃度為200 mg·kg-1干土?xí)r,接種菌株D-2時,可以使酸性土壤中啶蟲脒40 d的降解率達92.5%,中性土壤和堿性土壤中啶蟲脒的15d降解率分別為96.1%和89.6%。通過對不同土壤中降解的研究發(fā)現(xiàn),在酸性土壤中有利于菌株D-2降解能力的發(fā)揮。利用MiSeq高通量測序技術(shù)研究菌株D-2對不同土壤中不同濃度啶蟲脒進行生物修復(fù)的生態(tài)學(xué)效應(yīng)。三種土壤的Alpha多樣性分析結(jié)果表明,在酸性土壤和中性土壤中施加啶蟲脒會減少土壤中微生物群落的豐富度和多樣性。而接種菌株D-2可以增加土壤中微生物群落的豐富度和多樣性,菌株D-2能夠降解啶蟲脒去除毒害脅迫效應(yīng),豐富土壤中的微生物群落組成。在堿性土壤中,啶蟲脒和菌株D-2并不顯著影響土壤中微生物群落的豐富度。三種土壤的Beta多樣性分析結(jié)果表明,施加啶蟲脒僅影響堿性土壤的微生物群落結(jié)構(gòu),而接種菌株D-2則會改變酸性土壤和堿性土壤中的微生物的群落結(jié)構(gòu)。在啶蟲脒濃度為200 mg.kg-1干土并接種菌株D-2的情況下,對酸性和中性土壤細菌門水平的分析表明,在酸性土壤中,變形菌門的相對豐度顯著增加(35.4%);在中性土壤中,放線菌門的相對豐度有所增加(4.6%)。而對于堿性土壤中,只施加高濃度的啶蟲脒會增加變形菌門的相對豐度(11.4%)。根據(jù)已報道的啶蟲脒降解菌株所在的菌屬信息,在土壤細菌門水平上進行分析,發(fā)現(xiàn)三種土壤在施加啶蟲脒的情況下,假黃單胞菌屬的相對豐度會有一定的增加(增長了 0.03%～0.31%);在同時接種菌株D-2的情況下,假黃單胞菌屬(增長了 0.02%～0.37%)、假單胞菌屬(增長了 0.17%～0.97%)和寡養(yǎng)單胞菌屬(增長了 0～0.58%)都會有增加。在施加菌株D-2時,噬染料桿菌屬Pigmentiphaga(所占比例為1.25%～24.37%)都是優(yōu)勢菌屬,說明菌株D-2在啶蟲脒的降解過程中起到關(guān)鍵作用。 【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X592;X172

【圖文】：

描儀掃描發(fā)現(xiàn)，啶蟲脒在波長２４５邋ｎｍ處有明顯的特征吸收峰（圖ｌ－ｌａ）。當(dāng)啶蟲脒逡逑被降解時，相應(yīng)的特征吸收峰消失。經(jīng)過反復(fù)篩選和驗證，最終分離到一株啶蟲脒逡逑降解菌，命名為Ｄ－２。菌株Ｄ－２可在７２邋ｈ內(nèi)對啶蟲脒有明顯的降解效果（圖１－ｌｂ）。逡逑＿：ｊ邋八：逡逑之逡逑圖１－１富集液和菌株Ｄ－２對啶蟲脒的降解效果（紫外掃描）逡逑ａ：富集液；ｂ：菌株Ｄ－２逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＣＥ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋ａｎｄ邋ｓｔｒａｉｎ邋Ｄ－２邋（ＵＶ邋ｓｃａｎｎｉｎｇ）逡逑ａ，邋Ｔｈｅ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；邋ｂ，邋Ｓｔｒａｉｎ邋Ｄ－２逡逑ａ邐ｂ逡逑．蠢逡逑ｍ逡逑圖１－２菌株Ｄ－２的菌落照片（ａ）和電鏡照片（ｂ）逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈ邋（ａ）邋ａｎｄ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ邋（ｂ）邋ｏｆ邋ｓｔｒａｉｎ邋Ｄ－２逡逑２．２降解菌株Ｄ－２的鑒定逡逑菌株Ｄ－２在ＬＢ平板上成黃白色菌落，邊緣光滑，菌落凸起，革蘭氏染色陰性，逡逑短棒狀（０．４￣０．６邋｜0ｍ邋ｘ邋１．１￣１．６邋ｐｍ）（圖ｌ－２ａ，圖ｌ－２ｂ），好氧，無芽孢，無鞭毛。逡逑提取菌株Ｄ－２的總ＤＮＡ，以ＤＮＡ為模板，利用細菌１６ＳｒＲＮＡ基因的通用引物逡逑進行ＰＣＲ擴增，，得到約為１．５ｋｂ的片段。ＰＣＲ產(chǎn)物回收后與ｐＭＤ１８－Ｔ載體連接，轉(zhuǎn)逡逑化到五．ｃｏ／ｚ＇ＤＨ５ｃｔ中。挑取陽性克隆子進行測序后提交至ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫

ＡｇＣｌ沉淀，即可檢測降解過程中氯離子是否釋放（Ｂｅｒｇｍａｎｎ，邋＆Ｓａｉｎｉｋ，邋１９５７）。逡逑２結(jié)果與分析逡逑２．１菌株Ｄ－２對啶蟲脒的降解和代謝產(chǎn)物的ＨＰＬＣ檢測逡逑接種菌株Ｄ－２至ＭＭＡ培養(yǎng)基中，３０°Ｃ，１６０ｒｐｍ振蕩培養(yǎng)，定時取樣檢測啶脒的含量。由圖２－１可以看出，７２邋ｈ內(nèi)對５０邋ｍｇ．Ｌ－１啶蟲脒降解率達９９％以上，并且逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張玲玲;耿寶榮;;啶蟲脒對中華蟾蜍蝌蚪的急性毒性和微核核異常的誘導(dǎo)作用[J];福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年06期

2 賈雪晴;;新煙堿類殺蟲劑在作物保護中的應(yīng)用述評[J];寧夏農(nóng)林科技;2015年05期

3 楊瓊;王淑會;張文慧;楊田堂;劉永杰;;常用殺蟲劑對異色瓢蟲的毒力及其保護酶的影響[J];植物保護學(xué)報;2015年02期

4 樊龍飛;李明;李榮玉;郁艷;盧春;;水稻和土壤中噻蟲胺、啶蟲脒殘留量高效液相色譜分析[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年01期

5 張洪玉;吳清陽;張芝平;畢強;董建生;施順發(fā);葉振君;;環(huán)氧蟲啶的合成新工藝[J];世界農(nóng)藥;2014年06期

6 夏圍圍;賈仲君;;高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術(shù)評價[J];微生物學(xué)報;2014年12期

7 藺哲廣;孟飛;鄭火青;周婷;胡福良;;新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂健康的影響[J];昆蟲學(xué)報;2014年05期

8 邱成;;淺議土壤污染及其防治[J];四川農(nóng)業(yè)科技;2014年01期

9 楊光;;歐盟新煙堿類農(nóng)藥限制令出臺回顧[J];農(nóng)藥市場信息;2013年30期

10 于福強;黃耀師;蘇州;武恩明;王徵;于春睿;;新穎殺蟲劑氟啶蟲胺腈[J];農(nóng)藥;2013年10期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李健;殺蟲劑啶蟲脒的高效降解微生物篩選及代謝研究[D];上海交通大學(xué);2011年

本文編號：2712477