【摘要】：本論文以白腐菌木質(zhì)素降解酶為研究對(duì)象，從十二株白腐菌中篩選產(chǎn)木質(zhì)素降解酶能力強(qiáng)的菌株，利用層析技術(shù)將木質(zhì)素降解酶分離純化，并進(jìn)一步了解該酶的基本酶學(xué)性質(zhì)和特性，用于蒽醌染料SN4R的脫色研究，同時(shí)考察了產(chǎn)漆酶白腐菌對(duì)造紙堿木素的脫色能力。 所試白腐菌在限氮條件下未發(fā)現(xiàn)有錳過(guò)氧化物酶和木素過(guò)氧化物酶的生成，主要產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶為漆酶。其中產(chǎn)漆酶能力最強(qiáng)的是側(cè)耳(Pleurotus ostreatus 324)；次之為側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)青島黑，杏鮑菇(Pleurotus eryngii)，側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)5526；產(chǎn)漆酶能力較低的有香菇(Lentinus edodes9608)，以及側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)中的792、G1、G5和鮑魚(yú)菇；而雜色云芝(Polyporus versicolor)，灰管層孔(Fomes lignosus)，草菇(Votvariella volvcea)在此條件下不產(chǎn)漆酶。在富氮培養(yǎng)條件下，未發(fā)現(xiàn)有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的生成，主要木質(zhì)素降解酶為漆酶和錳過(guò)氧化物酶．在富氮培養(yǎng)條件下白腐菌產(chǎn)漆酶能力明顯低于限氮條件下產(chǎn)漆酶能力，高濃度的氮對(duì)漆酶生產(chǎn)有抑制作用。 糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus 324)在限氮條件下產(chǎn)漆酶能力較強(qiáng)，本論文研究了該菌的產(chǎn)漆酶能力，并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用性研究。白腐菌真菌Pleurotus ostreatus 324最佳產(chǎn)漆酶條件為：靜置條件下培養(yǎng)，溫度為30℃，培養(yǎng)基初始pH為5，三角瓶裝液量為20ml／250ml。在所有測(cè)試碳源中，纖維二糖、阿拉伯糖為最佳碳源；在氮源中，有機(jī)氮要優(yōu)于無(wú)機(jī)氮，如蛋白胨、酵母膏、酒石酸銨、尿素都是漆酶生產(chǎn)的良好氮源，當(dāng)培養(yǎng)基C／N＞10：1即高碳低氮培養(yǎng)條件下，有利于漆酶的形成；產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加0.5mmol%rL濃度的不同金屬離子，其中Ca~(2+)，Ca~(2+)有助于漆酶的產(chǎn)生；添加誘導(dǎo)劑ABTS(0.5-1mM／L)對(duì)漆酶的活性影響最明顯，，與對(duì)照相比可提高漆酶酶活5倍，約為410 U／ml。該酶產(chǎn)量明顯高于國(guó)內(nèi)外同類文獻(xiàn)報(bào)道，白腐菌Pleurotus ostreatus 324是漆酶的優(yōu)良生產(chǎn)者，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 白腐菌Pleurotus ostreatus 324漆酶，經(jīng)三步層析分離，純化為電泳級(jí)，純化倍數(shù)為26.5倍，回收率為38.3％。該漆酶單個(gè)亞基分子量為56.5kD，自然分子量為56kD。該酶在醋酸緩沖液中最適反應(yīng)pH為3.5，最適反應(yīng)溫度為65℃，在醋酸緩沖液(pH5.0)中，反應(yīng)溫度低于50℃時(shí)，漆酶非常穩(wěn)定；該漆酶能氧化ABTS和各種酚類化合物，尤其是對(duì)對(duì)位和鄰位甲氧基取代酚的氧化能力強(qiáng)，羥基取代酚次之，而對(duì)氨基取代酚、阿魏酸和焦醅酚的氧化能力相對(duì)較弱；疊氮化鈉對(duì)該漆酶有強(qiáng)烈的抑制作用。與其它真菌漆酶相比，無(wú)論是在分子量大小上，還是在酶學(xué)性質(zhì)上都明顯不同，可初步斷定Pleurotus 大連理工大學(xué)博士學(xué)位論文 ostreatus 324漆酶為一新的真菌漆酶。 漆酶是一種含銅多酚氧化酶，可催化酚類化合物和芳香胺的氧化，在小分子介體物 質(zhì)存在下，漆酶氧化范圍可進(jìn)一步擴(kuò)大。蔥醒染料活性艷藍(lán)SN4R可被該粗漆酶(30U/m1) 直接脫色，脫色最佳pH值為4.0，40℃為最佳脫色溫度，脫色時(shí)間為12小時(shí)，脫色率 為55%，但酶活與染料脫色率不呈正比關(guān)系。經(jīng)一系列SN4R脫色的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)純漆 酶和小分子物質(zhì)ABTS分別單獨(dú)使用時(shí)，都不能使蕙醒染料SN4R脫色，當(dāng)純漆酶中添加 小分子介體物質(zhì)ABTS時(shí)，可使SN4R脫色;顯然蔥醒染料SN4R不是漆酶底物，小分子還 原介體可介導(dǎo)漆酶與非酶底物染料之間的氧化作用，而使染料脫色。小分子介體物質(zhì) ABTS、對(duì)一甲氧基酚、黎蘆醇的添加，有助于染料脫色率的提高以及脫色時(shí)間的縮短，添 加一定濃度的對(duì)一甲氧基酚或黎蘆醇后，染料SN4RZ小時(shí)的脫色率可達(dá)8既以上。 白腐菌分泌胞外氧化酶一木素降解酶。這類氧化酶底物專一性不強(qiáng)，除降解木質(zhì)素外 還降解大量的芳香族污染物。首先觀察了四種白腐菌Pleurotus eryng王i，PolyPorus versicolor，尸leurotus口streatus和Fomesl妙osus在限氮和富氮培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)產(chǎn)木素過(guò) 氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶和漆酶的能力，由于尸leurotus ostreatus和尸leurotus eryng王i產(chǎn)酶 能力較強(qiáng)，用于堿木素的降解脫色效果較好，二者在限氮條件下n天對(duì)堿木素降解脫色 率為65%和72%。對(duì)于Pleurotus ostreatus犯4來(lái)說(shuō)，0.69/L CaZ+有助于該菌體生物量的增 加，對(duì)其產(chǎn)酶影響不明顯;10mg/L Mn2+有助于該菌錳過(guò)氧化物酶活性的提高;smg/L Cu2+ 可顯著提高該菌產(chǎn)漆酶能力，10天可使堿木素的降解脫色率達(dá)到90%。
【圖文】：

大連理工大學(xué)博士學(xué)位論文ha200150100圖3一1一第二次離子交換層析色譜圖Fig.3小4Chromatogr叩hieeurveson.ionexehanger.Colulnn:Q一SePharose(XL16/50).SamPle:elutedPeaksfromColumnSePhadexG一75.Startbuffer:20mMTris一HCI，PHS.0.Gradient:0一0.2MNaCIin20m加1Tris一HCI，PHS.0in30columnvolume.Flowrate:lmFmin.SylnbolsofaJ汀ow15theactivePeak2.2白腐菌PI~口亡口‘ostreatu歲324漆酶的分子量通過(guò)變性條件下聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS一PAGE)測(cè)得白腐菌尸leurotus口‘介已a(bǔ)tu:324漆酶的分子量為56.5kDa(圖3一1一6)。通過(guò)非變性條件下凝膠層析測(cè)得該酶分子量大約為56kDa。非變性條件下測(cè)得分子量與聚丙烯酞胺凝膠電泳所測(cè)結(jié)果基本一致，可以推斷該酶為單聚體蛋白。圖3一1一5粗漆酶凝膠電泳圖Fig.3小5SDS·PAGEoferudeextractoflaceaseLanel:Moleeularweightmarkers.LaneZ，3:CrUdeeXtract.64

大連理工大學(xué)博士學(xué)位論文ha200150100圖3一1一第二次離子交換層析色譜圖Fig.3小4Chromatogr叩hieeurveson.ionexehanger.Colulnn:Q一SePharose(XL16/50).SamPle:elutedPeaksfromColumnSePhadexG一75.Startbuffer:20mMTris一HCI，PHS.0.Gradient:0一0.2MNaCIin20m加1Tris一HCI，PHS.0in30columnvolume.Flowrate:lmFmin.SylnbolsofaJ汀ow15theactivePeak2.2白腐菌PI~口亡口‘ostreatu歲324漆酶的分子量通過(guò)變性條件下聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS一PAGE)測(cè)得白腐菌尸leurotus口‘介已a(bǔ)tu:324漆酶的分子量為56.5kDa(圖3一1一6)。通過(guò)非變性條件下凝膠層析測(cè)得該酶分子量大約為56kDa。非變性條件下測(cè)得分子量與聚丙烯酞胺凝膠電泳所測(cè)結(jié)果基本一致，可以推斷該酶為單聚體蛋白。圖3一1一5粗漆酶凝膠電泳圖Fig.3小5SDS·PAGEoferudeextractoflaceaseLanel:Moleeularweightmarkers.LaneZ，3:CrUdeeXtract.64
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：X788

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本文編號(hào)：2711149