【摘要】：鋁毒是限制酸性土壤上農(nóng)作物生產(chǎn)的最主要的影響因子,植物的耐鋁機(jī)制包括外部排斥和內(nèi)部耐受,其中有機(jī)酸的分泌是植物重要的外部排斥機(jī)理,也是研究的熱點(diǎn)。位于質(zhì)膜上的有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)子介導(dǎo)植物有機(jī)酸的分泌,是有機(jī)酸分泌的關(guān)鍵步驟。目前克隆到的有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)子并不多,而且盡管有機(jī)酸分泌具有明顯的A1誘導(dǎo)特征,但迄今還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)完全被鋁誘導(dǎo)表達(dá)的有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)子。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),A1脅迫可誘導(dǎo)飯豆根尖檸檬酸的分泌,且其分泌起始與施加A1脅迫之間有一個(gè)明顯的滯后期。本研究通過(guò)同源克隆手段從飯豆中克隆得到了該檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)子,并對(duì)其表達(dá)和功能進(jìn)行了研究。另一方面,盡管有機(jī)酸的分泌是植物重要的耐鋁機(jī)理,但不能解釋水稻的鋁耐性,本研究還以水稻為材料研究了果膠甲酯酶基因家族與鋁誘導(dǎo)的根伸長(zhǎng)受抑制間的關(guān)系。主要結(jié)果如下： 1.從頭合成的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)子VuMATE在飯豆鋁耐性中的作用 飯豆(Vigna umbellata)根系在鋁脅迫下可專一性的分泌檸檬酸,并且分泌被延遲了數(shù)小時(shí)。本研究采用同源克隆和RACE技術(shù)從飯豆根尖中分離了一個(gè)從頭合成(新合成)的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)子基因,由于其屬于MATE基因家族的成員,將其命名為VuMATE。 VuMATE編碼一個(gè)565個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。 VuMATE與己知的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)子具有高度的序列相似性,都包含12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,在跨膜域2和3之間都有一個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)中的環(huán)狀結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)也包含一段保守的氨基酸序列,推測(cè)其在檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有重要作用。多序列比對(duì)顯示,VuMATE與白羽扇豆的LaMATE親緣關(guān)系最近。 RT-PCR分析表明VuMATE在鋁處理前沒(méi)有表達(dá),是第一個(gè)完全被鋁誘導(dǎo)表達(dá)的有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)子基因。VuMATE的表達(dá)部位僅限定在0-1cm根尖(鋁毒的靶位),在1-2cm的根成熟區(qū)和葉片中都不表達(dá)。VuMATE的表達(dá)量隨著A1處理濃度和處理時(shí)間的增加而增加,這與飯豆鋁脅迫下根系檸檬酸的分泌模式相一致。VuMATE的表達(dá)不受二價(jià)金屬Cd和Cu的誘導(dǎo),三價(jià)金屬La可以誘導(dǎo)VuMATE的表達(dá),但同時(shí)加入A1會(huì)使表達(dá)量進(jìn)一步提高。 亞細(xì)胞定位顯示VuMATE是一個(gè)膜蛋白。 將VuMATE異源表達(dá)于爪蟾卵母細(xì)胞中的功能分析表明,VuMATE可以介導(dǎo)顯著的跨越質(zhì)膜的內(nèi)向電流,內(nèi)向電流的強(qiáng)度依賴于細(xì)胞外的H+離子(也可能是Na+)。注射14C標(biāo)記的檸檬酸發(fā)現(xiàn),VuMATE可以直接介導(dǎo)14C檸檬酸的轉(zhuǎn)運(yùn),其轉(zhuǎn)運(yùn)能力也依賴于細(xì)胞外H+。 通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法在番茄中過(guò)表達(dá)VuMATE賦予了番茄分泌檸檬酸的能力,提高了番茄對(duì)鋁的耐受性。 所有這些結(jié)果說(shuō)明VuMATE是飯豆中負(fù)責(zé)檸檬酸分泌的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)子。通過(guò)比較飯豆檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)子與其它已知檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)子的異同,發(fā)現(xiàn)了飯豆檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)子具有不同于其它檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)子的特點(diǎn)。2.水稻果膠甲酯酶基因與鋁誘導(dǎo)的根伸長(zhǎng)抑制相關(guān) 水稻是小粒谷類中最耐鋁的物種,但有機(jī)酸的分泌不能解釋其強(qiáng)耐鋁性,有研究表明鋁主要和細(xì)胞壁果膠的負(fù)電荷結(jié)合,而果膠的負(fù)電荷的產(chǎn)生與果膠甲酯酶密切相關(guān)。為此,我們通過(guò)對(duì)水稻果膠甲酯酶基因家族的表達(dá)分析探討了其與鋁誘導(dǎo)根伸長(zhǎng)抑制的關(guān)系。 從DFCI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了水稻果膠甲酯酶基因家族的35個(gè)成員,其cDNA序列的GC含量很高,每個(gè)成員具有不同的基因結(jié)構(gòu),所編碼的蛋白質(zhì)分為兩組(一組只有PME結(jié)構(gòu)域,一組在PME結(jié)構(gòu)域前還有PMEI結(jié)構(gòu)域),系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系顯示水稻果膠甲酯酶可以分為5類。 當(dāng)用25μM Al處理鋁敏感水稻品種浙輻802("Zhefu802")3h,根伸長(zhǎng)被抑制了40%,根尖細(xì)胞壁的PME活性提升了20%。這時(shí),35個(gè)PME基因的表達(dá)變化分為4組：A組不表達(dá),B組上調(diào)表達(dá),C組下調(diào)表達(dá),D組表達(dá)量不變。由于B組上調(diào)表達(dá)的8個(gè)PME基因與其酶活變化一致,我們初步認(rèn)為這8個(gè)基因與鋁誘導(dǎo)的根伸長(zhǎng)抑制相關(guān)。 我們進(jìn)一步在鋁耐性水稻品種日本晴("Nipponbare")中驗(yàn)證了篩選出的8個(gè)基因與鋁脅迫的關(guān)系。結(jié)果表明：25μM Al處理3h不影響日本晴根伸長(zhǎng),此時(shí),這8個(gè)基因的表達(dá)也不受影響；但當(dāng)將Al處理濃度提高到50μM Al時(shí),日本晴的根伸長(zhǎng)受抑制也達(dá)到40%,此時(shí),除了2個(gè)不表達(dá)的基因外,其它6個(gè)基因的表達(dá)都明顯上調(diào)。由此,進(jìn)一步證明了這8個(gè)基因與鋁誘導(dǎo)的根伸長(zhǎng)抑制相關(guān)。 8個(gè)基因?qū)ζ渌饘倜{迫的響應(yīng)不同于鋁脅迫,暗示著不同的PME基因?qū)Σ煌慕饘倜{迫做出響應(yīng)。 綜上所述,我們從水稻果膠甲酯酶基因家族中篩選出了8個(gè)與鋁誘導(dǎo)的根伸長(zhǎng)抑制相關(guān)的基因,為從分子水平上研究細(xì)胞壁在抗鋁脅迫中的作用提供了切入點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：X173

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 馮英明,喻敏,王昌全,劉家友;鋁毒誘導(dǎo)植物細(xì)胞反應(yīng)研究進(jìn)展[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年03期

2 郭安源;朱其慧;陳新;羅靜初;;GSDS:基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)[J];遺傳;2007年08期

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本文編號(hào)：2706480