【摘要】：鋁毒害是植物在酸性土壤上生長的主要限制因子之一。植物在長期適應酸性土壤過程中發(fā)展出了多種應對鋁脅迫的解毒機制,如分泌有機酸解鋁毒,利用液泡將鋁隔離等。而參與這些重要的解鋁毒過程的基因在水稻和擬南芥中都受轉錄因子ART1/STOP1的調控。ART1基因的表達不受鋁毒影響,但它下游受調控的抗鋁毒基因的表達受鋁毒誘導,因此可能存在與ART1進行互作的蛋白共同來調控下游抗鋁毒基因的表達。本文利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選能與ART1相互作用的蛋白,以期對ART1的調控機制有進一步了解。蕎麥是一種高抗高積累鋁的植物,能在酸性土壤上生長至葉片鋁含量15000 ppm而不表現(xiàn)出鋁毒害癥狀。然而由于基因組序列的缺少,蕎麥內在的分子機制基本是一片空白。本文利用高通量測序技術對苦蕎轉錄本進行測序,并對苦蕎中的ART1和ART1下游基因ALS1的同源基因進行研究。本文的主要研究結果如下:(1)構建了總克隆數(shù)1.5×105CFU、平均插入片段長度1 K的cDNA均一化文庫構建。通過酵母雙雜交對cDNA文庫進行篩選,得到22個ART1的候選互作蛋白。根據(jù)基因注釋信息對候選蛋白初步篩選,選定10個候選蛋白,并通過互換誘餌蛋白和捕獲蛋白的載體,在酵母中進行互作確認,結果發(fā)現(xiàn),一種含單個鋅指結構域的轉錄因子OsVOZ1在酵母中與ART1表現(xiàn)出較強的互作,其同源蛋白OsVOZ2在酵母中自激活。Split-LUC方法在煙草細胞內證實OsVOZ1和OsVOZ2分別具有與ART1互作的能力。實時定量RT-PCR表明OsVOZ1和OsVOZ2的表達不受鋁的誘導。為研究OsVOZ1和OsVOZ2是否參與水稻抗鋁毒,對水稻osvoz1和osvoz2突變體進行研究,發(fā)現(xiàn)OsVOZ1和(OsVOZ2單突變不影響水稻的鋁敏感性。雙突株系osvoz2;OsVOZ1-Ri會使水稻正常根伸長變短,然而鋁處理條件下其根長顯著長于野生型,說明OsVOZ1和OsVOZ2雙突增加植株的鋁抗性。osvoz2;OsVOZ1-Ri株系中ART1的表達受鋁誘導上調,暗示OsVOZ1和OsVOZ2可能作為ART1的負調控因子參與水稻抗鋁毒。擬南芥atvoz1atvoz2抗鋁性的增加揭示VOZ1和VOZ2在水稻和擬南芥抗鋁毒過程中的功能具有一定保守性。(2)對苦蕎轉錄本進行測序并重新組裝、去除冗余序列,最終得到約40000個高質量的轉錄本。對苦蕎根尖和基部樣品的RNA-seq數(shù)據(jù)進行分析,發(fā)現(xiàn)鋁處理會優(yōu)先誘導作用于抵抗細胞壁毒性和氧化應激的基因的表達,同時,參與三羧酸循環(huán)的關鍵酶基因的表達都沒有顯著改變,暗示有機酸代謝過程可能不是鋁誘導的有機酸分泌的限速步驟。檸檬酸在蕎麥鋁轉運過程中起至關重要的作用,從蕎麥轉錄組中鑒定出兩個 MATE 家族的基因,FtFRDL1 和 FtFRDL2,FtFRDL1 和 FtFRDL2 都屬于 FRD3亞家族且都受鋁誘導上調表達,暗示了它們很有可能參與鐵和鋁向地上部的運輸。另一方面,在水稻和擬南芥中保守且只有單個拷貝的耐鋁基因ART1/STOP1、ALS1和STAR1在苦蕎中均有兩個拷貝,猜測這可能是蕎麥高抗高積累鋁的重要原因。(3)蕎麥中ART1的同源蛋白FtARL1和FtARL2跟STOP1/ART1 一樣,都含有四個高度保守的C2H2鋅指結構域。進化樹分析發(fā)現(xiàn)FtARL1和FtARL2跟擬南芥STOP1更近。表達分析結果表明:FtARL1在根部的表達不受鋁的誘導,而FtARL2的表達受鋁誘導略有上調。將YFP分別與FtARL1和FtARL2的N端和C端融合,在煙草表皮細胞中表達融合蛋白,結果顯示FtARL1同時定位于細胞核和細胞質,而FtARL2只定位于細胞核。上述結果暗示了 FtARL1和FtARL2在蕎麥中可能行使不同的功能。通過將FtARL1導入擬南芥stop對突變株中,發(fā)現(xiàn)表達FtARL1的回復突變株能夠完全回復STOP1突變導致H+敏感性,部分回復鋁敏感性,這跟相關受STOP1調控的H+和鋁抗性基因的表達回復一致。(4)ALS1在蕎麥中有兩個同源基因,FtALOL1和FtALOL2。FtALOL2在根部的表達能夠專一、靈敏地受鋁的誘導上調,10 μM鋁即能完全誘導FtALOL2的上調;而FtALOL1對多種金屬離子有響應:鋁處理能下調FtALOL1表達,Cu處理使FtALOL1表達上調。為研究FtALOL1的組織表達模式,將2 kb FtAOL1的啟動子與GUS報告基因融合,并利用發(fā)根農桿菌將其導入蕎麥并最終得到轉基因的毛根,GUS染色結果表明:FtALOL1主要在中柱表達。將YFP分別與FtALOL1和FtALOL2的N端融合,在煙草表皮細胞中表達融合蛋白,結果顯示FtALOL1定位于細胞膜,而FtALOL2在煙草中出現(xiàn)錯誤聚集。酵母異源表達實驗結果顯示FtALOL2在酵母中具有鋁轉運活性。擬南芥回復突變株als1-1;FtALOL1跟alsl-1的鋁敏感性沒有顯著差別,而FtALOL2的表達增加了擬南芥的鋁敏感性。綜上所述,ART1互作蛋白OsVOZ1和OsVOZ2可能作為ART1的負調控因子參與抗鋁毒過程,且OsVOZ1和OsVOZ2功能存在冗余。VOZ1和VOZ2在擬南芥和水稻解鋁毒方面中具有一定保守性。高抗高積累鋁作物苦蕎中ART1及下游基因ALS1均存在兩個拷貝,且兩個拷貝之間的表達定位模式存在分化,提示苦蕎中ART1和ALS1同源基因通過進化不同的功能來應對該作物對鋁的抗性和運輸。
【圖文】：

ＵＡＳ－Ｇａｌ２邋ＴＡＴＡ－Ａｄｅ２邋ＵＲＡ３：：ＭＥＬ１邋ＵＡＳ＾Ｍｅｌｌ邋ＴＡＴＡＡＵＲ１－ＣＭＥＬＩ）。逡逑載體：ｐｉ＾ＳＦ－Ｂｌｕｎｔ購于ＴｒａｎｓＧｅｎ邋Ｂｉｏｔｅｃｈ；用于酵母雙雜交系統(tǒng)的ｐＧＢＫＴ７和ｐＧＡＤＴ７逡逑的載體圖譜如圖２－１。逡逑生物試劑：２邋ｘ邋Ｔａｑ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ？邋ＩＩ邋Ｏｎｅ邋Ｓｔｅｐ邋Ｃｌｏｎｉｎｇ邋Ｋｉｔ邋和邋ＨｉＳｃｒｉｐｔ？邋Ｉｓｔ逡逑Ｓｔｒａｎｄ邋ｃＤＮＡ邋Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋Ｋｉｔ購自Ｖａｚｙｍｅ公司；限制性內切酶均購自Ｂｉｏｌａｂｓ公司；Ｔ４逡逑連接酶、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬ高保真酶和酵母營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基購于Ｔａｋａｒａ公司；膠回逡逑１３逡逑

由于ＡＲＴ１在酵母中具有潛在的轉錄激活活性，因此首先通過酵母單雜交實驗找逡逑出ＡＲＴ１的自激活位點。將ＡＲＴ１進行６種不同長度和位置的截短，將其構建至逡逑ＰＧＢＫＴ７，分別命名為Ｔ１至Ｔ６，構建載體示意圖及酵母單雜交的點板結果如圖２－４：逡逑跟之前報道的結果一致，含空載ｐＧＢＫＴ７的酵母在ＳＤ－Ｔｒｐ的培養(yǎng)基上生長良好，逡逑在ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｈｉｓ及ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｈｉｓ－Ａｄｅ的選擇培養(yǎng)基上則不能生長，而表達ＢＤ－ＡＲＴ１的酵逡逑母能在ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｈｉｓ及ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｈｉｓ－Ａｄｅ的培養(yǎng)基上生長，證實ＡＲＴ１具有自激活功能逡逑（Ｙａｍａｊｉ邋ｅｔａｌ．，邋２００９）。將ＡＲＴ１分害ＩＪ為不含鋅指的前半段（Ｔ１）和包含全部鋅指的后逡逑半段（Ｔ２），，結果表明含有鋅指區(qū)的后半段表現(xiàn)出了自激活能力，因此我們認為激活逡逑位點在后半段；對ＡＲＴ１重新進行分段，分為包含一個鋅指區(qū)的前半段（Ｔ３）及包含逡逑三個鋅指的后半段（Ｔ４），結果發(fā)現(xiàn)Ｔ３沒有激活能力，而Ｔ４能自激活；對Ｔ４再次逡逑分段
【學位授予單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S511;S517;X503.231

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本文編號：2701722