【摘要】：路易斯安那鳶尾(Louisianairis)屬鳶尾科鳶尾屬(IrisL.),因其具有喜水濕、抗性強(qiáng)、常綠、生物量相對(duì)大而廣泛用于園林的水體綠化和景觀配植。目前我國(guó)耕地和河流湖泊重金屬污染嚴(yán)重,治理刻不容緩。植物修復(fù)技術(shù)綠色環(huán)保,是鉛等重金屬萃取修復(fù)相對(duì)徹底的污染修復(fù)治理技術(shù)。自然中鉛超富集植物多由于生物量小等難以推廣,本文以路易斯安那鳶尾為材料,從植物對(duì)鉛富集能力、理化以及轉(zhuǎn)錄組、基因功能等多層面進(jìn)行研究,為進(jìn)一步進(jìn)行植物抗(耐)性發(fā)生機(jī)理機(jī)制以及培育高效選擇性吸收和積累重金屬離子應(yīng)用型超積累植物新種質(zhì)研究提供依據(jù)。主要內(nèi)容與結(jié)論如下:1.路易斯安那鳶尾9個(gè)品種中'Professor Neil'對(duì)Pb吸收和富集量最大。隨著Pb溶液濃度的升高,植株的株高、新發(fā)不定芽數(shù)、存活葉片數(shù)、根長(zhǎng)、根數(shù)、鮮重及干重均呈下降趨勢(shì),而葉片、根狀莖和根系Pb含量也隨Pb濃度的增加而增加,順序?yàn)楦蹈鶢钋o葉片。葉片在800 mg/L Pb時(shí)達(dá)到4,011 mg/kg DW。隨著Pb濃度的升高,根系耐受指數(shù)(IT)逐漸下降,在大于600mg/L Pb后存在顯著性差異。根至莖Pb轉(zhuǎn)移率(R/R)和莖至葉Pb轉(zhuǎn)移率(R/L)都呈先上升再下降的趨勢(shì),R/R在800mg/L Pb處理時(shí)達(dá)到最大值10.02%,R/L在600mg/L Pb處理時(shí)達(dá)到最大值57.78%。電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察到Pb主要富集在根的細(xì)胞壁和胞間隙中。2.Pb脅迫下路易斯安那鳶尾品種'Professor Neil'葉片葉綠素下降不明顯。MDA、Pro、SOD、POD、CAT含量和O2-產(chǎn)生速率普遍隨著Pb處理濃度0-400 mg/L增加而緩慢上升,表明適度的Pb脅迫可通過植物體內(nèi)抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)的誘導(dǎo)合成得到緩解,但在600-800mg/L時(shí)表現(xiàn)急劇上升或下降,表明高濃度處理誘導(dǎo)植物代謝加快或受到不可逆的傷害。Pb脅迫下隨著0-600 mg/L濃度的升高和1-7 d時(shí)間的推移,GSH和Cys含量逐漸增加并產(chǎn)生顯著差異,尤其GSH起著重要的Pb解毒作用。3.采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了路易斯安那鳶尾品種'Professor Neil'根部Pb處理后的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)情況,共計(jì)獲得150,328,034個(gè)讀取(reads),組裝了 562,409個(gè)轉(zhuǎn)錄本(Transcript)和350,869個(gè)Unigene,其中有50.72%的Unigene在公共數(shù)據(jù)庫中有注釋。對(duì)已注釋的Unigene進(jìn)行分類和功能分析,有58,722個(gè)Unigene注釋能到KOG數(shù)據(jù)庫,涉及25個(gè)功能類別;有102,265個(gè)Unigene在GO數(shù)據(jù)庫中有注釋,共分為3個(gè)生物本體過程(ontology);有13,204個(gè)Unigene參與了 52個(gè)上調(diào)KEGG代謝通路,有15,666個(gè)Unigene參與了 102個(gè)下調(diào)KEGG的代謝路徑。差異基因的表達(dá)分析指出,在Pb處理和對(duì)照中,共檢測(cè)到3,869個(gè)顯著變化的基因,其中1,850個(gè)上調(diào)表達(dá),2,019個(gè)下調(diào)表達(dá);在整個(gè)代謝通路中有2類植物絡(luò)合素合成酶(PCS)、1類3型金屬硫蛋白、4類Nramp金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、2類轉(zhuǎn)錄因子的基因被顯著差異表達(dá)。RT-qPCR檢測(cè)了 12個(gè)路易斯安那鳶尾響應(yīng)Pb脅迫相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)一步支持和驗(yàn)證了 Pb脅迫相關(guān)基因的活性和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的可靠性。4.通過對(duì)路易斯安那鳶尾轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,獲得LiPCS1的中間片段,利用RACE技術(shù)分別克隆與拼接,全長(zhǎng)為1,683 bp,預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)含501 aa,蛋白質(zhì)含有Cys-56、His-162和Asp-182三個(gè)必需的氨基酸活性位點(diǎn)和重金屬離子傳感器基序C368C369RMTC373VRC376,與其他同源PCS進(jìn)行保守性分析發(fā)現(xiàn)相似位點(diǎn)達(dá)91.6%。路易斯安那鳶尾LiPCS1在內(nèi)花瓣表達(dá)最高,與其他組織產(chǎn)生顯著差異,雄蕊、葉和莖的表達(dá)量基本在同一水平,外花瓣、根和雌蕊表達(dá)較低,雌蕊最低。隨著鉛處理時(shí)間增加,LiPCS1在根系和葉片中表現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),在3h時(shí)達(dá)到最大值而產(chǎn)生了顯著差異。5.獲得Nramp基因家族中路易斯安那鳶尾 LiNramp2、LiNramp3、LiNramp5、LiNramp6的中間片段,利用RACE技術(shù)分別克隆到LiNramp2、LiNramp3、LiNramp5和LiNramp6基因,全長(zhǎng)分別為1,786、2,082、2,090、2,142bp,預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)分別含519、546、544、539 aa,蛋白質(zhì)具有11或12次跨膜結(jié)構(gòu)域,與其他同源Nramp進(jìn)行保守性分析發(fā)現(xiàn)相似位點(diǎn)80%以上,表明LiiNramp同其他同源基因保守性很高。LiNramp家族在路易斯安那鳶尾葉片和雄蕊中表達(dá)較高,一直在雌蕊中表達(dá)最低,根和莖表達(dá)量差別不大,根稍高于莖。隨著Pb處理時(shí)間增加,LiNramp2基因在根系中的表達(dá)量緩慢下降,在葉片中的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),總體上沒有顯著差異,LiNramp3、LiNramp5、LiNramp6基因在根系和葉片中的表達(dá)量都呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì),產(chǎn)生了顯著差異。
【圖文】：

植物中發(fā)現(xiàn)的Ｐｂ耐受相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括ＮｔＣＢＰ４轉(zhuǎn)運(yùn)子和ＡＢＣｍｚｉ等（１９９９）在植物中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的質(zhì)膜通道鈣調(diào)蛋白ＮｔＣＢＰ４，２＋通過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因?qū)⑦@一蛋白在其他植物上過進(jìn)了植物對(duì)Ｐｂ的吸收。而ＭＣＡＰ４基因編碼一個(gè)植物鈣調(diào)素，于２０００和擬南芥中分離得到，并被證明其負(fù)責(zé)Ｐｂ２＋通過質(zhì)膜通道向胞內(nèi)運(yùn)輸（Ｓｕｎ００）。ＭＣ５Ｐ４過量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因煙草地上部分Ｐｂ含量明顯增加，同時(shí)對(duì)增強(qiáng)。轉(zhuǎn)ＭＣ５／＾ｚｌＣ：（去除Ｃ端ＣａＭＢＤ結(jié)構(gòu)域和環(huán)核苷酸結(jié)合域）基耐受性提高。Ｔ－ＤＮＡ插入破壞擬南芥ａＶＧＣｉ基因（ＭＣ５Ｐ４同源基因）了對(duì)Ｐｂ的耐受性。ＡＢＣ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括酵母ＹＣＦ１和擬南芥ＡＢＣ亞族Ｇ功能蛋白。７ＣＦ／基因編碼一個(gè)液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，承擔(dān)將異質(zhì)物轉(zhuǎn)運(yùn)ｏｎｇ等（２００３）發(fā)現(xiàn)超表達(dá)酵母７ＣＦ／基因的擬南芥和酵母突變體（ＤＴＹ１Ｐｂ的耐性，且積累更多量的Ｐｂ。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化將ｙｃＦ／基物量的芥菜（Ａ邐中。轉(zhuǎn)基因芥菜植株鉛濃度高于野生型１．６倍，鉛的積累量高于野生型１．７至ＩＪ２．２倍（Ｂｈｕｉｙａｎｅｔａｌ．２０１１ａ）。它ＦＣＦ７的轉(zhuǎn)基因植物可以用來修復(fù)鉛污染。ＡｔＡＴＭ３／ＡｔＨＭＡ３屬于ＡＢＣ亞家

６本研究的目的和主要研究?jī)?nèi)容逡逑本文以具有適合濕地栽培、生長(zhǎng)速度快、生物量大、適應(yīng)性廣、抗性強(qiáng)、觀賞性逡逑好等特性的路易斯安那鳶尾（Ｌｏｕｉｓｉａｎａ邋ｉｒｉｓ）為材料（圖１－３），從植物的Ｐｂ吸收、逡逑富集特性、積累的細(xì)胞學(xué)、生理生化影響以及植物Ｐｂ響應(yīng)及其調(diào)控的理機(jī)制研究，逡逑為進(jìn)一步培育高效選擇性吸收和積累重金屬離子應(yīng)用型超積累植物新種質(zhì)研究提供逡逑理論依據(jù)。逡逑本研究在以往對(duì)鳶尾屬植物重金屬抗性等研究的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖１－２，開展逡逑的主要研究?jī)?nèi)容包括：一、從引進(jìn)的路易斯安那鳶尾品種中篩選鉛富集能力強(qiáng)的抗性逡逑品種，通過不同濃度鉛處理從生長(zhǎng)、顯微結(jié)構(gòu)上觀察路易安那鳶尾的富集特性，評(píng)價(jià)逡逑耐性、抗性和富集能力；二、從通過不同濃度鉛處理對(duì)耐鉛品種根系和葉片生理生化逡逑代謝的影響分析植物富集和耐性發(fā)生的理化基礎(chǔ)；三、采用高通量測(cè)序ＲＮＡ－Ｓｅｑ技術(shù)逡逑分析鉛處理下的路易斯安那鳶尾植物根轉(zhuǎn)錄響應(yīng)差異，統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)的差異表達(dá)基逡逑因；四、利用轉(zhuǎn)錄組得到的序列與ＲＡＣＥ的方法，克隆與重金屬吸收、螯合和轉(zhuǎn)運(yùn)有逡逑關(guān)的ＰＣＳ、ｉＶｍ—等基因，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)其推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)、逡逑系統(tǒng)進(jìn)化樹和跨膜結(jié)構(gòu)域分析，研究其組織特異性表達(dá)以及對(duì)鉛脅迫的響應(yīng)以及基因’逡逑調(diào)控機(jī)理機(jī)制。逡逑路易斯安那鳶尾＾逡逑Ｐｂ吸收積累特性邐邐逡逑ｐ＾－ｉ邋ｒ＾－ｉ邐丨邋１邋
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：X52;X173;S682.19

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2697288