【摘要】： 六六六(HCH)是一種曾經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣為使用的有機(jī)氯殺蟲劑，主要包含α，β，γ和δ四種異構(gòu)體。由于其具有高毒性和高穩(wěn)定性，給環(huán)境帶來了嚴(yán)重的污染。Sphingobium sp.BHC-A是一株六六六降解菌，可以在有氧條件下完全降解六六六的四種異構(gòu)體，尤其對(duì)于β和δ兩種異構(gòu)體具有高效降解能力。 本文旨在從Sphingobium sp.BHC-A中克隆出相應(yīng)的降解α、β、γ和δ四種異構(gòu)體的基因，并闡明其降解方式與降解途徑。 利用PCR的方法，以BHC-A菌株的基因組DNA為模板，擴(kuò)增出了8個(gè)與降解α和γ六六六相關(guān)的lin基因：linA、linB2、linC2、linD2、linE2、linF2、linX2與linR2，并測(cè)定各基因的核苷酸序列。結(jié)果表明這些基因與GeneBank上登陸的α和γ六六六降解基因的同源性均在98％以上，證明降解α與γ異構(gòu)體的基因具有高度的保守性，同時(shí)也證明了在BHC-A菌株體內(nèi)存在著一條由這8個(gè)降解基因組成的能夠?qū)ⅵ僚cγ異構(gòu)體降解為β-酮己二酸的降解途徑，該途徑與報(bào)道的α與γ異構(gòu)體降解途徑相一致。 通過Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變法將自殺性質(zhì)粒pKTY320中的Tn5轉(zhuǎn)座子插入到六六六降解菌Sphingobium sp.BHC-A中，經(jīng)過初篩和復(fù)篩獲得了一株完全喪失β異構(gòu)體降解功能突變株BHC-A45。采用高鹽沉淀蛋白質(zhì)法從中抽提到高質(zhì)量的基因組DNA.采用鳥槍法構(gòu)建基因組DNA文庫，篩選到一個(gè)含有轉(zhuǎn)座子序列的陽性克隆pBHC1.對(duì)陽性克隆中轉(zhuǎn)座子側(cè)翼進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tn5正好插入linB2基因的341位核苷酸處。利用PCR的方法擴(kuò)增出linB2基因，將其連接到廣宿主載體pBBR1MCS-5上得到pBBR1MCS-5A，通過三親結(jié)合的方法將其導(dǎo)入突變子BHC-A45中，進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示突變子BHC-A45中在轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒pBBR1MCS-5A后，β異構(gòu)體降解功能得到了恢復(fù)。將linB2基因連接到表達(dá)載體pET29a上，轉(zhuǎn)化E.coli BL21，獲得的陽性克隆顯示出了降解β異構(gòu)體的活性．實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明linB2基因就是β異構(gòu)體的降解基因。經(jīng)誘導(dǎo)后linB2基因可以在E.coli BL21中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。 利用GC／MS與NMR對(duì)UnB2轉(zhuǎn)化β異構(gòu)體的產(chǎn)物進(jìn)行的分析，證明β異構(gòu)體首先被轉(zhuǎn)化為β-五氯環(huán)己醇(β-PCHL)，β-PCHL繼續(xù)被LinB2轉(zhuǎn)化生成β-2，3，5，6-四氯-1，4-環(huán)己二醇(β-TDOL)。β-TDOL不僅是LinB2轉(zhuǎn)化的終產(chǎn)物，也是Sphingobium sp.BHC-A降解β異構(gòu)體的終產(chǎn)物。 LinB2對(duì)于d異構(gòu)體也具有類似于β異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化活性，實(shí)驗(yàn)證明該酶可以將d異構(gòu)體首先轉(zhuǎn)化為d-五氯環(huán)己醇(d-PCHL)，再繼續(xù)轉(zhuǎn)化d-PCHL生成產(chǎn)物d-2，3，5，6-四氯-1，4-環(huán)己二醇(d-TDOL)，d-TDOL可以繼續(xù)被Sphingobium sp.BHC-A所降解。對(duì)于α和γ異構(gòu)體，LinB2沒有顯示出轉(zhuǎn)化活性。 通過PCR的方法從BHC-A基因組中克隆出linA、linC2、linD2和linX2基因，將這些基因分別連接到表達(dá)載體pET29a上，在E.coli BL21中進(jìn)行表達(dá)。在表達(dá)產(chǎn)物中只有LinA顯示出對(duì)于d異構(gòu)體具有轉(zhuǎn)化活性。GC／MS證明LinA可以將d異構(gòu)體連續(xù)脫去2個(gè)氯化氫分子，產(chǎn)生中間產(chǎn)物δ-五氯環(huán)己烯(d-PCCH)與不穩(wěn)定終產(chǎn)物d-1，3，4，6-四氯-1，4-環(huán)己二烯(d-1，4-TCDN)。d-1，4-TCDN在沒有其他酶催化的情況下會(huì)自發(fā)脫去1個(gè)氯化氨分子生成終產(chǎn)物1，2，4-三氯苯(1，2，4-TCB)。LinB2可以以d-PCCH作為底物，經(jīng)過連續(xù)的兩步水解脫氯作用，經(jīng)歷一個(gè)未知的中間產(chǎn)物，生成d-2，3，5-三氟-5-環(huán)己烯-1，4-二醇(d-2，3，5-TCDL)。同時(shí)LinB2還可以以d-1，4-TCDN作為底物，經(jīng)過連續(xù)的兩步水解脫氯作用，，產(chǎn)生中間不穩(wěn)定產(chǎn)物d-2，4，5-三氯-2，5-環(huán)己二烯-1-醇(d-2，4，5-DNOL)生成d-2，5-二氯-2，5-環(huán)己二烯-1，4-二醇(d-2，5-DDOL)。d-2，4，5-DNOL在反應(yīng)中會(huì)自發(fā)脫去1個(gè)氯化氫分子生成終產(chǎn)物2，5-二氯苯酚(2，5-DCP)。LinA與LinB2組成了一個(gè)網(wǎng)絡(luò)狀的d異構(gòu)體降解途徑。d-2，5-DDOL為終產(chǎn)物，Sphingobium sp.BHC-A對(duì)其沒有降解活性。而d-2，3，5-TCDL則可以被Sphingobium sp.BHC-A繼續(xù)降解。
【圖文】：

以BHC一A菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了明顯的特異性片段(圖1一ZC)。回收的PCR產(chǎn)物與pMD18一 TVeetor相聯(lián)，轉(zhuǎn)化五 eoljDH5a，涂布轉(zhuǎn)化子到含有 IO0mg/LAmp的LB平板上，挑取白色菌落，堿法抽提其質(zhì)粒(圖1一ZA)。酶切驗(yàn)證插入片斷的大小(圖1一ZB)，陽性克隆命名為P18A，送樣測(cè)序。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性smin~94℃變性lmin一62℃退火305一72℃延伸305，循環(huán)反應(yīng)29次~72℃延伸smin一4℃保溫。二3二309::6協(xié)、J心，‘飛36!2322蘇Glbp2000 103(-750500250100圖1一Zt組質(zhì)粒p，8^的酶聯(lián)、隴切圈Figl· 2Plas而 dsPro川 esofP18AMl，入廿五月 d111maker:A，質(zhì)粒p18A:B

以BHC一A菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了明顯的特異性片段(圖l一3C)�；厥盏腜CR產(chǎn)物與 pMD18一 TVeetor相聯(lián)，轉(zhuǎn)化云 eoljDH5a，涂布轉(zhuǎn)化子到含有 100mg/LAmp的LB平板上，挑取白色菌落，堿法抽提其質(zhì)粒(圖1一3A)。酶切驗(yàn)證插入片斷的大小(圖1一3B)，陽性克隆命名為p18B2，送樣測(cè)序。PCR反應(yīng)條件:95，C預(yù)變性smin~94，C變性lmin一68，C退火305~72，C延伸lmin，循環(huán)反應(yīng)29次一72℃延伸smin一4℃保溫。了InBZ序列測(cè)定
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：Q78;X592

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2697201