【摘要】： 群體感應是一種普遍存在的微生物細胞與細胞之間的信息交流機制。群體感應使單細胞微生物之間能夠在“群體水平”上“相互協(xié)作”,完成一些單細胞無法進行的生物過程。以�；呓z氨酸內(nèi)酯(Acylated Homoserine Lactone, AHL)作為信號分子的群體感應系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陰性細菌中,并在許多生物過程中都扮演了重要角色。 微生物是污染物生物降解的主力軍,但是群體感應在污染物生物降解過程中的作用缺乏研究。僅一篇文獻報道AHL信號分子的添加能夠改變活性污泥的微生物菌群組成,并提高活性污泥污染物處理能力的穩(wěn)定性。但AHL信號分子是否能在污染物降解過程中合成,群體感應對微生物的生物降解能力的調(diào)控及機制尚未見報道。本學位論文以芳香族化合物作為典型的難清除有毒污染物,以AHL介導的群體感應作為典型研究對象來探討群體感應在污染物降解過程中的作用。這將為我們從微生物群體視角來認識污染物生物降解的調(diào)控過程提供有用信息,同時也對從群體角度開發(fā)新的高效生物降解策略有著重要意義。 本論文首先擬以AHL群體感應系統(tǒng)和芳香族污染物生物降解過程作為典型對象建立一個簡單的研究模型。通過篩選得到了一株具有AHL群體感應系統(tǒng)且有較強芳香族污染物降解能力的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CGMCC 1.860,并對其降解特性進行了分析。PCR及生物信息學分析表明,該菌苯酚羥化酶基因簇由一個轉(zhuǎn)錄因子(phcR)和六個亞基(phcPONMLK)組成,而兒茶酚間位途徑基因在一個由轉(zhuǎn)錄因子(nahR)和十個結(jié)構基因組成的NAH基因簇上,關鍵酶兒茶酚2,3-雙加氧酶(C230)由nahH編碼。另一方面,分析確認了該菌具有完整的Rhl群體感應系統(tǒng)(rhlIR基因簇),并在LB培養(yǎng)基中具有短鏈AHL合成能力。進一步通過同框缺失(In-frame deletion)技術,構建了Rhl群體感應系統(tǒng)的缺失菌株△rhlI,△rhlIR。該簡單模型以P. aeruginosa CGMCC1.860為供試菌株,芳香族污染物為底物,可用于研究Rhl群體感應系統(tǒng)對芳香族污染物生物降解的調(diào)控作用。 AHL信號分子定量檢測方法非常缺乏,尤其是對有毒環(huán)境樣品中AHL信號分子的定量檢測方法至今未見報道。本研究通過篩選得到了一株能夠在BHL(N-butyryl-homoserine lactone,一種AHL,Rhl群體感應系統(tǒng)的信號分子)添加條件下產(chǎn)生綠色色素(pyocyanin)的銅綠假單胞菌,通過基因工程手段將該菌株構建成了一個以色素產(chǎn)生為信號輸出的BHL定量檢測生物傳感器,利用該傳感器可以簡單地通過分光光度法對BHL進行定量檢測。其最低檢測限較以往的方法有大幅降低。同時對該生物傳感器的抗干擾能力、穩(wěn)定性、可靠性進行了驗證,并且在污水樣品中得到了成功的應用。該方法為進一步深入研究群體感應信號分子在污染物降解過程中的積累規(guī)律及群體感應對污染物降解過程的調(diào)控機制提供了簡單經(jīng)濟的定量檢測工具。 雖然已報道從活性污泥等污染物處理過程中分離到了能夠在復合培養(yǎng)基中產(chǎn)生AHL信號分子的菌株,但是至今未有報道表明AHL信號分子能否在污染物生物降解過程中合成。同時關于群體感應對微生物污染物降解能力的影響作用至今未見報道。通過生物傳感器檢測、薄層層析(TLC)和HPLC-APCI-MS/MS分析表明P. aeruginosa CGMCC1.860在芳香族污染物降解過程中能夠合成BHL(N-butyryl homoserine lactone)和HHL(N-hexanoyl-homoserine lactone),且BHL為主要成分。接著,我們發(fā)現(xiàn)P. aeruginosa CGMCC 1.860的AHL粗提物能夠提高該菌的苯酚降解能力,但不含有短鏈AHL的粗提物對該菌的苯酚降解能力無明顯影響。該結(jié)果表明外源添加的短鏈AHL(主要是BHL,由rhlI合成)能夠提高銅綠假單胞菌的苯酚降解能力。由此推測Rhl群體感應系統(tǒng)在該過程中對生物降解具有調(diào)控作用。通過比較野生型菌株、△rhlI、△rhlIR及其回補菌株的降解能力,結(jié)果表明Rhl群體感應系統(tǒng)能夠提高銅綠假單胞菌的芳香族污染物降解能力。 我們進一步探索了Rhl群體感應系統(tǒng)對芳香族污染物降解關鍵酶酶活及基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。以苯酚降解作為典型有毒芳香族污染物生物降解過程,通過對三種條件下(野生型,△rhlI,△rhlI+BHL)菌株降解過程的比較分析表明,Rhl群體感應系統(tǒng)能夠在轉(zhuǎn)錄水平上正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子nahR表達,以nahH為代表的NAH基因簇也受到Rhl群體感應系統(tǒng)的正向調(diào)控,同時C230酶活也受到群體感應的正向調(diào)節(jié)。由此推測,Rhl群體感應系統(tǒng)對兒茶酚間位途徑的促進是其提高芳香族污染物降解能力的主要原因。另一方面,在對數(shù)生長后期,Rhl群體感應系統(tǒng)對苯酚羥化酶系統(tǒng)phcR和phcP,全局性調(diào)控因子relA, spoT, crc的表達都表現(xiàn)出負調(diào)控。這些結(jié)果顯示了群體感應在污染物降解過程對細胞調(diào)控的復雜性,同時也為進一步深入研究提供了基礎。 本研究建立了一種用于環(huán)境樣品中AHL信號分子定量檢測的生物傳感器,證明了AHL信號分子能夠在污染物降解過程中合成,并發(fā)現(xiàn)Rhl群體感應系統(tǒng)能夠提高銅綠假單胞菌芳香族污染物降解能力,進一步獲得了群體感應系統(tǒng)對芳香族污染物調(diào)控的分子信息。這些信息和工具為今后進一步深入研究群體感應對芳香族污染物生物降解的調(diào)控機制,從群體視角有目的地調(diào)節(jié)芳香族污染物的生物降解,奠定了良好的基礎,并對于研究其他群體感應系統(tǒng)在其他污染物降解過程中的作用也具有良好的借鑒作用。
【圖文】：

圖IJAHL介導的群體感應的生物學作用概述1131Fig.1.3Biol鮑iealrolesofAHLmediatedquorumsensi吧性131研究表明，AHL介導的群體感應在革蘭氏陰性細菌中調(diào)控了大量的生物學過

其中研究比較清楚的是 Pseudomonasaeruginosa的群體感應系統(tǒng)。 paer林ginosa有兩種相對獨立的AHL介導的群體感應系統(tǒng)，，即Las群體感應系統(tǒng)和 Rhl群體感應系統(tǒng)(圖1.4)l’，’SJ。p。eruginosa的Las群體感應系統(tǒng)由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LasR和3一oxo一c12HsL(N-(3一oxo卜dodecanoyl一 homoserinelactone，odDHL)合成酶Lasl組成;Rhl群體感應系統(tǒng)由C4HSL(N-but”嘆 1homose血 elactone，B批)合成酶Rhll和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Rh1R組成(圖1.4)【’51。當信號分子BHL或odDHL的濃度達到一定閉值，它們就與相應的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Rh1R或LasR的N端結(jié)合形成復合體并改變調(diào)節(jié)蛋白的構象，使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白C末端能夠與目標基因特定的DNA區(qū)域結(jié)合，從而調(diào)控目標基因的表達(圖1.4)[’泌]。群體感應Las系統(tǒng)主要控制著一些毒性因子的產(chǎn)生，如彈性蛋白酶和溶血素等【2743]。而R五l系統(tǒng)調(diào)控著諸如pyocy田吐n合成、鐵載體及鼠李糖合成等過程[l5]。轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學的研究表明
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：X172

【引證文獻】

相關期刊論文 前1條

1 吳曉琴;張夢思;周衛(wèi);魏仁零;;高效聯(lián)苯降解菌的篩選及其特性[J];環(huán)境工程學報;2012年09期

相關碩士學位論文 前1條

1 張夢思;聯(lián)苯、吡啶降解菌的篩選及降解研究[D];武漢科技大學;2011年

本文編號：2695342