【摘要】：氮素仍然是當(dāng)前地表水體水質(zhì)污染的重要源頭之一,新的脫氮處理工藝、新的填料和新的脫氮細(xì)菌等的探索和研究是生物脫氮技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。隨著各種新工藝的不斷推出,工藝構(gòu)筑物內(nèi)脫氮菌群的效能成為制約新工藝推廣和使用的關(guān)鍵因素之一。生物技術(shù)的引入帶來了新的變化。 本文擬利用原生質(zhì)體融合技術(shù),采用脫氮效能較高的原生態(tài)菌株作為原生質(zhì)體融合的親本菌株,以此建立微生物的轉(zhuǎn)化體系,來獲取更高效的脫氮菌,以期為城市污水處理的脫氮提供新的研究方向,為提高脫氮菌的脫氮效率開辟新的方法。本文首先進(jìn)行了原生態(tài)氨氧化菌、硝化菌和反硝化菌的篩選,分別繪制生長曲線并測(cè)定其性能。接著進(jìn)行了原生態(tài)組合脫氮菌的脫氮性能研究,之后進(jìn)行了優(yōu)選反硝化菌的原生質(zhì)體融合及優(yōu)選融合子的脫氮性能研究,并通過性能對(duì)比和16S rDNA基因測(cè)序手段甄別了優(yōu)選融合子的親本菌,對(duì)比了原生態(tài)組合脫氮菌與優(yōu)選融合子組合脫氮菌的脫氮效能。 本文的主要結(jié)論有: (1)通過專用培養(yǎng)基,采用極限稀釋法和平板劃線法,篩選獲得三株較高效的反硝化菌FX1,FX2和FX3,經(jīng)鑒定,菌株FX1和FX3為芽孢桿菌屬,FX2為沙雷氏菌屬。繪制反硝化菌FX1,FX2和FX3的生長曲線,進(jìn)行脫氮性能對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,菌株FX1,FX2和FX3均有脫氮功能,菌株的四個(gè)生長周期較為明顯,0-4h為其延緩期,4-16h為對(duì)數(shù)期,TIN去除率明顯增大,16-20h后為穩(wěn)定期,TIN去除率仍有所增長,但增速減緩,20h后為衰亡期,對(duì)TIN的去除效果明顯減弱,直至穩(wěn)定。三株菌株中,FX2為反硝化效果最優(yōu),FX1次之,FX3菌株最差;單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在溫度低于30℃時(shí),其脫氮率隨溫度升高而增大,但當(dāng)溫度高于30℃后,其脫氮率呈隨溫度升高下降的趨勢(shì);正交實(shí)驗(yàn)表明:影響反硝化菌株FX1的脫氮效率的因素的主次順序依次為:培養(yǎng)時(shí)間溫度pH值;影響菌株FX2的脫氮效率的因素的主次順序依次為:溫度培養(yǎng)時(shí)間pH值。反硝化菌株FX1各因素中最佳的反硝化條件為:培養(yǎng)時(shí)間為14 h,溫度35℃,pH為7.5;反硝化菌株FX2的最佳反硝化條件為:培養(yǎng)時(shí)間為16 h,溫度25℃,pH為7.0。 (2)根據(jù)顯色反應(yīng),確定氨氧化富集培養(yǎng)基I作為實(shí)驗(yàn)用氨氧化菌富集培養(yǎng)基,分離、純化得到1株氨氧化菌A1。繪制其生長曲線,表明其生長周期較長,前3天生長非常緩慢,NH3-N的去除率也相應(yīng)較低,第4-7天是氨氧化速率明顯提高;在確定硝化菌富集培養(yǎng)基Ⅰ為較優(yōu)硝化菌培養(yǎng)基后,分離、純化得到3株硝化菌X1、X2和X3。選定硝化菌X2進(jìn)行最優(yōu)硝化條件的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,影響硝化菌X2平均日硝化速率的因素的主次順序依次為:培養(yǎng)時(shí)間溫度pH;硝化菌X2的最佳硝化條件為:溫度30℃,pH值為7.0,培養(yǎng)時(shí)間為6d。 (3)配制模擬污水,進(jìn)行原生態(tài)組合脫氮菌的脫氮實(shí)驗(yàn)。測(cè)得配置后的模擬生活污水主要水質(zhì)指標(biāo)為:COD=300-350mg/L,TP=6.9-9.2mg/L,NH3-N=16.2-20.5 mg/L。以總氮去除率計(jì)時(shí),只有氨氧化菌或硝化菌時(shí),總氮去除率很低,當(dāng)氨氧化菌和硝化菌組合時(shí),總氮去除率略有提高,表現(xiàn)出復(fù)配效應(yīng),但效能仍然較低。當(dāng)氨氧化菌、硝化菌和反硝化菌組合時(shí),總氮去除率有較為明顯的提高,均高于90%,且組合Ⅰ的總氮去除率較優(yōu)于組合Ⅱ。菌種組合過程中,表現(xiàn)出明顯的群體效應(yīng)。 (4)優(yōu)選脫氮菌的原生質(zhì)體融合實(shí)驗(yàn)及融合子組合脫氮菌的脫氮實(shí)驗(yàn)。將優(yōu)選得到的氨氧化菌A1、硝化菌X2以及反硝化菌FX1、FX2進(jìn)行了紫外誘變和抗藥性篩選。在紫外誘變過程中,FX1和FX2對(duì)紫外線的耐受能力較強(qiáng),A1菌株次之,而X2菌株對(duì)紫外線照射最為敏感。為了保證致死效果,FX1菌株和FX2菌株照射80s,得到突變菌株FXB1和FXB2�？顾幮院Y選過程中,采用青霉素G鈉鹽和鏈霉素作為抗藥性標(biāo)記,在選擇壓為40μg/mL時(shí)進(jìn)行了抗藥性正突變菌株的篩選,將有單重抗藥性的突變菌株進(jìn)行了5次傳代培養(yǎng),選擇具有穩(wěn)定遺傳性的正突變菌株作為原生質(zhì)體融合的親本菌株。原生質(zhì)體制備過程中,所采用的溶菌酶濃度為400μg/mL,酶解溫度為30℃,酶解時(shí)間為10-16h。原生質(zhì)體融合過程中,采用平均分子量為6000,質(zhì)量濃度為40%的PEG促融。實(shí)驗(yàn)中采用的促融時(shí)間為6min,促融架橋的Ca2+濃度為0.015mol/L。在經(jīng)過6代傳代培養(yǎng)后,經(jīng)雙抗平板篩選,得到R1、R2、R3、R4、R5等5種融合子。 (5)將挑選出的融合子R1、R2、R3、R4、R5和親本菌株A1、X2和FX1、FX2(作為對(duì)照)按10%的接種量接入250mL的模擬污水(將富集培養(yǎng)基稀釋5倍)中進(jìn)行脫氮實(shí)驗(yàn),篩選出融合子R2為反硝化效果得到明顯提高的反硝化菌融合子。通過16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增及序列分析,進(jìn)行DNA含量對(duì)比,判斷融合子R2的親本菌株是反硝化菌FX2。 (6)繪制融合子R2的生長曲線。結(jié)果表明,通過融合之后,融合子的生長量有一定增加。利用模擬污水測(cè)定了其脫氮性能,在0-4h階段優(yōu)選融合子R2與親本菌FX2的反硝化效能比較接近,但在4-8h時(shí),兩種菌的反硝化效能開始明顯變化,融合子R2的總氮去除率優(yōu)于親本菌FX2,這種優(yōu)勢(shì)一直持續(xù)到22h,最大差別為27.58%(16h時(shí))。說明通過原生質(zhì)體融合技術(shù),可使優(yōu)選反硝化菌的脫氮效能得到27%左右的提高。 (7)進(jìn)行了原生態(tài)組合脫氮菌和優(yōu)選融合子組合脫氮菌的脫氮實(shí)驗(yàn)。將原生態(tài)組合脫氮菌中的優(yōu)勢(shì)組合A1+X2+FX1與優(yōu)選融合子組合脫氮菌A1+X2+R2進(jìn)行脫氮效能對(duì)比實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,優(yōu)選融合子組合脫氮菌的脫氮效能一直略優(yōu)于原生態(tài)組合脫氮菌,特別是在0-8h期間較為明顯,在后續(xù)時(shí)段,雖有優(yōu)勢(shì),但差別較小,說明優(yōu)選融合子的加入提高了組合脫氮菌的效能,但隨著時(shí)間的增長,其優(yōu)勢(shì)逐漸變小。
【圖文】：

項(xiàng)目 亞硝酸菌 硝酸菌細(xì)胞形狀 橢球或棒狀 橢球或棒狀細(xì)胞尺寸/μm 1×1.5 0.5×1.0革蘭氏染色 陰性 陰性世代期/h 8-36 12-59自養(yǎng)性 專性 兼性需氧性 嚴(yán)格好氧 嚴(yán)格好氧氧化 1g NH4+-N 增值量/g 0.146 0.019最大比增長速率/(μm/h) 0.04-0.08 0.02-0.06產(chǎn)率系數(shù) Y/(基質(zhì)細(xì)胞mgmg) 0.04-0.13 0.02-0.07飽和常數(shù) K/(mg/L) 0.6-3.6 0.3-1.7在硝化反應(yīng)中，NH4+-N 向 NO3--N 的轉(zhuǎn)化過程中總氮量未發(fā)生變化。氮元素的價(jià)態(tài)變化見圖 1-1 所示。

和光均可作為反硝化菌的能量來源[20-24]。Pseudononas（假單胞菌）和Alcaligene產(chǎn)堿桿菌屬）是自然界最普遍的反硝化菌，相對(duì)于這兩個(gè)屬而言，其它反硝化菌只在某些特殊的環(huán)境中才居優(yōu)勢(shì)，，出現(xiàn)頻率較低[25]。.2.3 反硝化作用細(xì)菌的反硝化過程可以表示為：NO3－NO2-NO N2O N2關(guān)[26,27]。細(xì)菌反硝化作用原理如圖 1-3 所示：N2硝酸還原酶亞硝酸還原酶NO 還原酶O 還原酶
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：X703

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2688548