發(fā)布時(shí)間：2020-05-29 01:54

【摘要】：方面,隨著現(xiàn)代工業(yè)的不斷發(fā)展,金屬污染逐漸成為威脅地球生命安全的重要因素。另一方面,一些金屬作為抗菌器材在許多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用,為人類(lèi)生活尤其是醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)帶來(lái)極大便利。這兩者都是金屬對(duì)細(xì)胞毒性的客觀反應(yīng)。這使得金屬的細(xì)胞毒性機(jī)理日益成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。眾多研究將金屬的毒性歸因于氧化應(yīng)激,即通過(guò)產(chǎn)生活性氧化物質(zhì)破壞細(xì)胞的DNA、蛋白等組分而使細(xì)胞致毒。然而最新研究表明銅對(duì)大腸桿菌致毒時(shí)首先破壞細(xì)胞中心代謝通道中一類(lèi)關(guān)鍵性的鐵-硫簇脫水酶,且該作用源于銅的強(qiáng)親硫性。銀、汞、鎘、鋅、鉛、鎳、鈷和錳與銅類(lèi)似同樣具備強(qiáng)親硫性,都屬于柔性金屬的范疇,因此推測(cè)這些金屬的毒性機(jī)理存在相似性。本研究系統(tǒng)研究了各柔性金屬對(duì)大腸桿菌的抑制作用、對(duì)細(xì)胞體外含外露[4Fe-4S]簇的延胡索酸酶A (fumA)的作用以及生長(zhǎng)抑制臨界濃度下對(duì)細(xì)胞體內(nèi)各類(lèi)酶的作用,對(duì)柔性金屬的毒性機(jī)理進(jìn)行了全面深入的分析,表明了該類(lèi)酶為柔性金屬銀、汞、鎘和鋅致毒的第一靶點(diǎn),確認(rèn)了金屬的“親硫性”為其致毒的關(guān)鍵性因素。研究主要內(nèi)容包括： 1.金屬對(duì)細(xì)胞毒性機(jī)理的探索 研究已經(jīng)證明鐵使細(xì)胞致毒的原因是因?yàn)樗艽呋疐enton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基(·OH)而破壞細(xì)胞。銅、三價(jià)鉻與鐵同樣具備該能力,且抗壞血酸能夠作為一種促氧化劑而促進(jìn)金屬的還原及Fenton反應(yīng)的循環(huán)發(fā)生。為了探索銅對(duì)細(xì)胞的致死率與氧化應(yīng)激的關(guān)系,且驗(yàn)證銅毒性與羥基自由基導(dǎo)致的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞的猜想,研究了Cu(Ⅱ)與抗壞血酸(L-AscA)體系對(duì)E. coli的致死率,并與同能參與Fenton反應(yīng)的Fe(Ⅲ)和Cr(Ⅲ)的作用進(jìn)行了比較分析,進(jìn)而用電子自旋共振技術(shù)(ESR)分析了各體系產(chǎn)生的OH的量與致死率的關(guān)系。結(jié)果表明：LAscA的加入極大增強(qiáng)了Cu(Ⅱ)對(duì)E. coli的致死率,且兩者共存體系下,E. coli死亡率呈Cu(Ⅱ)濃度依賴(lài)。相應(yīng)的,0.01%L-AscA的加入加倍了0.2mM Cu(Ⅱ)體系中的·OH濃度,與致死率分析中L-AscA的加入極大增強(qiáng)了Cu(Ⅱ)的毒性一致；此外,L-AscA/Cu(Ⅱ)共存體系中,Cu(Ⅱ)濃度高于0.1mM時(shí),產(chǎn)生的·OH濃度與Cu(Ⅱ)濃度成正比,同樣與致死率分析中Cu(Ⅱ)濃度依賴(lài)結(jié)果相吻合。而200μM的Fe(Ⅲ)和Cr(Ⅲ)未能檢測(cè)到羥基自由基的產(chǎn)生,它們對(duì)細(xì)胞的毒性也相對(duì)弱于Cu(Ⅱ)。分析結(jié)果綜合表明在致死劑量下Cu(Ⅱ)的確能誘發(fā)·OH的產(chǎn)生,且產(chǎn)生量與銅對(duì)大腸桿菌的致死率成正相關(guān)。 但有趣的是,當(dāng)Cu(Ⅱ)濃度為0.02mM時(shí),與0.01%L-AscA共存體系下,ESR無(wú)法檢測(cè)到·OH,然而該體系對(duì)E. coli的毒性反而大于檢測(cè)到較高·OH濃度的0.2mM Cu(Ⅱ)單獨(dú)系統(tǒng)。這意味著,在較低Cu(Ⅱ)濃度下,存在氧化應(yīng)激之外的其它毒性機(jī)制。與此同時(shí),最新研究表明,由于Cu(Ⅱ)尤其是Cu(Ⅰ)的強(qiáng)親硫性,在非致死劑量下便能破壞E. coli中外露的鐵-硫簇脫水酶而成為其致毒的首要原因,該研究成果確切解釋了本研究中出現(xiàn)的這一矛盾現(xiàn)象。 2.柔性金屬對(duì)E. coli的抑制作用分析 銅為柔性金屬中的一種,為了驗(yàn)證這種由于強(qiáng)親硫性而致毒的機(jī)理是否具有共通性,首先分析了銀、汞、鎘、鋅、鉛、鎳、鈷、錳在標(biāo)準(zhǔn)基本培養(yǎng)基中對(duì)E. coli的抑制作用。并以銀為代表,深入分析了其抑制作用的影響因素。 結(jié)果表明,在簡(jiǎn)單基本培養(yǎng)基中,極低濃度的Ag(Ⅰ)和Hg(Ⅱ)(0.15μM)便能抑制E. coli生長(zhǎng),這與這兩種金屬公認(rèn)的極強(qiáng)抗菌性相一致。較高濃度的Ni(II)、Co(Ⅱ)(分別為400μM和200μM)才開(kāi)始抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)；其它柔性金屬未表現(xiàn)出明顯抑制作用；此外,銀對(duì)E. coli的抑制作用與好氧或厭氧狀態(tài)無(wú)關(guān),而與培養(yǎng)基種類(lèi)、培養(yǎng)基組分和菌液濃度高度相關(guān),表明了其毒性與氧化應(yīng)激無(wú)關(guān)。 3.柔性金屬對(duì)活體細(xì)胞外fumA的作用 延胡索酸酶A (fumA)是一種典型的鐵-硫簇脫水酶,因?yàn)槠滂F-硫簇外露很容易成為一些有毒物質(zhì)的攻擊對(duì)象。為了驗(yàn)證柔性金屬是否能破壞[4Fe-4S]簇而使fumA失活,首先在厭氧條件下提純了延胡索酸酶A,并逐一測(cè)定了上述八種柔性金屬對(duì)純化fumA活性的作用。通過(guò)底物保護(hù),失活fumA的活性還原、ESR對(duì)失活后fumA的Fe-S簇結(jié)構(gòu)解析以及酶失活過(guò)程中同步鐵原子釋放等研究手段對(duì)柔性金屬的作用機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)分析。 微摩爾濃度的Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)和相對(duì)較高濃度的Cd(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)能以極快的速度使純化fumA失去活性,使fumA失活的能力與其親硫性強(qiáng)弱相吻合,但高達(dá)毫摩爾濃度的Pb(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Co(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)未對(duì)fumA (?)舌性產(chǎn)生影響。ESR和鐵離子釋放分析證實(shí)了各金屬作用于酶的活性位點(diǎn)[4Fe-4S]簇,而且失活后的酶能夠通過(guò)Fe-S簇重建而重新獲得活性。Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)作用后fumA的[4Fe-4S]簇被完全降解,而Zn(Ⅱ)作用下失活后則部分呈[3Fe-4S]形式。 4.柔性金屬對(duì)活體細(xì)胞內(nèi)各類(lèi)酶的作用。 一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是鐵-硫簇酶是否為柔性金屬Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)使細(xì)胞致毒過(guò)程中的首要攻擊目標(biāo)。為此必須通過(guò)細(xì)胞活體內(nèi)的研究進(jìn)行確認(rèn)。因此,首先測(cè)定了各金屬對(duì)E. coli的生長(zhǎng)-抑制劑量；繼而在對(duì)應(yīng)邊界劑量下,分析了各金屬對(duì)細(xì)胞中含外露[4Fe-4S]簇的脫水酶活性的影響,同時(shí)研究了各金屬對(duì)Fe-S簇組裝(Isc)系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明致毒邊界劑量下的Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)便能破壞外露的[4Fe-4S]簇酶fumA、異丙基蘋(píng)果酸異構(gòu)酶和6-磷酸葡萄糖脫水酶,而且失活后的酶活性同樣可以被還原。而且這四種金屬不能使幾種其它類(lèi)型的酶失活,這些酶包括不含F(xiàn)e-S簇的p-半乳糖苷酶、蘋(píng)果酸脫氫酶以及含有內(nèi)嵌式鐵-硫簇的Ndh Ⅰ脫氫酶；此外四種金屬都能破壞E coli中的鐵-硫簇組裝系統(tǒng)。結(jié)果綜合表明了活體細(xì)胞內(nèi)各金屬在開(kāi)始抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的劑量下便能破壞這一類(lèi)含外露[4Fe-4S]簇的脫水酶,且其作用具有專(zhuān)一性。 總之,本研究結(jié)果表明了柔性金屬的毒性機(jī)理存在共通性。柔性金屬Cu(Ⅰ)、Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)在對(duì)E.coli致毒時(shí),首先破壞細(xì)胞中含外露[4Fe-4S]簇的一類(lèi)脫水酶。且該作用是由于各金屬共同的強(qiáng)親硫性,通過(guò)破壞酶的活性位點(diǎn)[4Fe-4S]簇而使酶失活,其致毒能力與各金屬親硫性強(qiáng)弱相一致。
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：X172

【引證文獻(xiàn)】

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1 范鳳霞;混合菌群FF對(duì)活性黑5的脫色降解研究[D];東華大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：2686193