【摘要】： 鎘(Cd)是生物毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一，其遷移性很強(qiáng)，且極易被植物吸收并積累，通過食物鏈富集對人體產(chǎn)生慢性中毒，因此鎘污染對生態(tài)環(huán)境、食品安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。植物提取修復(fù)是一種利用植物對重金屬等污染物的超積累能力清除污染物的環(huán)境治理技術(shù)，該技術(shù)的應(yīng)用前景關(guān)鍵在于揭示植物對重金屬的超積累機(jī)制。 東南景天(Sedum alfredii Hance)是在我國東南部地區(qū)一些古老的鉛鋅礦上發(fā)現(xiàn)的一種新的鎘超積累植物。本論文以超積累生態(tài)型(hyperaccumulating ecotype，HE)東南景天和非超積累生態(tài)型(non-hyperaccumulating ecotype，NHE)東南景天為材料，采用營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，運(yùn)用透射電鏡、組織化學(xué)、生化分析、蛋白質(zhì)雙向電泳分離和生物質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)等方法技術(shù)，研究了鎘脅迫下東南景天的生理響應(yīng)及比較蛋白質(zhì)組學(xué)．取得的主要研究結(jié)果如下： 1．超積累生態(tài)型東南景天對鎘具有異常耐性和超積累能力。當(dāng)鎘處理濃度高于10μM時，非超積累生態(tài)型東南景天嚴(yán)重受害，生長受抑制，根長、根表面積、根系直徑、根系體積和根系活力都顯著地降低，地上部和根部生物量(干重)相比對照顯著降低(達(dá)31．2％～46．8％)。超積累生態(tài)型東南景天在100μM鎘處理7天條件下，地上部鎘含量和積累量分別達(dá)到4246 mg kg~(-1)DW和370μgplant~(-1)。高濃度鎘脅迫下對超積累生態(tài)型根系生長抑制不明顯，同時其良好的根系形態(tài)與活力的維持有助于其對鎘吸收及從根系轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部。 2．通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，高濃度的鎘脅迫對東南景天根分生細(xì)胞的毒害癥狀主要表現(xiàn)在細(xì)胞壁增厚、細(xì)胞空泡化、質(zhì)壁分離、質(zhì)膜和根表皮破壞，并受到細(xì)菌侵染，但鎘對超積累生態(tài)型毒害相比非超積累生態(tài)型要小的多。超微結(jié)構(gòu)研究表明，鎘脅迫對東南景天葉肉細(xì)胞器影響最嚴(yán)重的是葉綠體和線粒體。鎘脅迫導(dǎo)致東南景天尤其是非超積累生態(tài)型細(xì)胞器中的葉綠體、線粒體腫脹，嚴(yán)重的則出現(xiàn)葉綠體扭曲變形的情況。高濃度的鎘使東南景天細(xì)胞質(zhì)組分流失，葉綠體基質(zhì)類囊體腫脹和結(jié)構(gòu)松散，嗜鋨顆粒明顯地增多并變大，說明在逆境的條件下，葉綠體片層合成受阻，光合作用平衡被打破，出現(xiàn)衰老跡象，進(jìn)而使得植物葉片老化。 3．兩種生態(tài)型東南景天體內(nèi)膜質(zhì)過氧化水平及H_2O_2和O_2·-含量隨著外界鎘處理濃度的增加而提高，鎘毒害作用導(dǎo)致了東南景天體內(nèi)處于氧化脅迫，但超積累生態(tài)型東南景天比非超積累生態(tài)型具有更強(qiáng)的鎘脅迫適應(yīng)能力。原位顯影法研究證實(shí)鎘脅迫導(dǎo)致東南景天體內(nèi)活性氧自由基(H_2O_2和O_2·-)過量積累，NADPH氧化酶主動地參與了兩種生態(tài)型東南景天的生理過程。BSO(谷胱甘肽合成抑制劑)的滲透處理使超積累生態(tài)型東南景天葉片受害加據(jù)，H_2O_2和O_2·-積累分別增加了31％和13％，但BSO滲透處理對非超積累生態(tài)型東南景天葉片活性氧自由基影響不顯著，表明超積累生態(tài)型東南景天體內(nèi)谷胱甘肽可能參與對鎘誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧自由基代謝的調(diào)控。 4．在低濃度鎘(≤μM)脅迫下非超積累生態(tài)型東南景天體內(nèi)SOD、G-POD及APX等抗氧化保護(hù)酶的活性增強(qiáng)，但更高濃度鎘則明顯的抑制了其抗氧化系統(tǒng)活性。然而，，超積累生態(tài)型東南景天體內(nèi)抗氧化酶如CAT、G-POD、APX及GR則是在鎘處理濃度≤100μM時失活，而后在更高濃度的鎘刺激下則增強(qiáng)，推測高濃度鎘導(dǎo)致H_2O_2的積累進(jìn)而啟動了抗氧化系統(tǒng)的二次防御作用。鎘處理24h后，兩種生態(tài)型東南景天根系和葉片中抗壞血酸(AsA)含量顯著升高，且兩種生態(tài)型東南景天葉片中的DHA(脫氫抗壞血酸)／AsA比率在鎘處理?xiàng)l件下一直維持在1的狀態(tài)即趨于還原態(tài)。研究結(jié)果表明兩種生態(tài)型東南景天體內(nèi)抗氧化物酶和抗壞血酸對鎘脅迫均有明顯響應(yīng)，但二者不是造成兩種生態(tài)型對鎘的積累和耐性能力差異的主要原因。超積累生態(tài)型東南景天根系和葉片中谷胱甘肽(GSH)含量顯著地高于非超積累生態(tài)型，且超積累生態(tài)型東南景天體內(nèi)GSH含量隨著鎘處理濃度的加大和處理時間的延長而顯著提高，但鎘脅迫對非超積累生態(tài)型體內(nèi)GSH含量影響不顯著，這表明GSH可能在超積累生態(tài)型東南景天對鎘的耐性和超積累性狀方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。 5．為了探討GSH對東南景天鎘脅迫耐性的影響，我們通過用谷胱甘肽合成抑制劑(BSO)預(yù)處理來降低植物體內(nèi)的GSH含量。超積累生態(tài)型東南景天在BSO和Cd復(fù)合處理24 h或更長時間后，其葉片中H_2O_2含量相比單獨(dú)Cd處理要高得多，這與葉片內(nèi)活性氧自由基原位顯影結(jié)果一致，表明谷胱甘肽合成對鎘誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧自由基有積極的抵抗作用，從而有助于增強(qiáng)植物對鎘毒害效應(yīng)的抵御能力。此外，超積累生態(tài)型(HE)東南景天在BSO和Cd復(fù)合處理24 h后，其根系中H_2O_2含量相比單獨(dú)Cd處理要高24％。與只有Cd處理相比，超積累生態(tài)型東南景天根系和葉片中GSH含量在BSO和Cd復(fù)合處理8天后根系和葉片中GSH含量降低了40％，同時，BSO和Cd復(fù)合處理使超積累生態(tài)型東南景天根系和葉片中鎘濃度分別降低了41％和36％。這些結(jié)果表明，GSH合成代謝在超積累生態(tài)型東南景天對鎘耐性和吸收調(diào)控中起到信號傳導(dǎo)作用，一方面作為抗氧化劑參與活性氧代謝，另一方面通過螯合Cd~(2+)參與超積累生態(tài)型東南景天體內(nèi)鎘解毒過程。 6．通過比較多種蛋白提取方法，發(fā)現(xiàn)通過苯酚抽提-TCA／丙酮沉淀法相結(jié)合制備東南景天葉和根組織總蛋白比較適合雙向電泳(2-DE)分析。通過該方法，能有效地去除干擾物質(zhì)及樣品中的鹽離子，有利于等電聚焦，使電壓能很快上升到設(shè)定高壓值；此外，還可以降低次生代謝物質(zhì)的干擾、減少蛋白降解，起到濃縮蛋白的作用。 7．利用雙向電泳技術(shù)研究了東南景天不同生態(tài)型蛋白質(zhì)組差異及鎘脅迫下的蛋白質(zhì)表達(dá)，并通過MALDI-TOF-MS及ESI-MS初步鑒定了49個蛋白質(zhì)可能與鎘耐性或積累相關(guān)。這些蛋白質(zhì)包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶／加氧酶大亞基、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子家族、成熟酶、根邊緣細(xì)胞特異蛋白、肌動蛋白、激素反應(yīng)蛋白家族、延伸因子1α、組蛋白H2A、含CheY類似受體和Fis型HTH兩個結(jié)構(gòu)域的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白、天冬氨酰蛋白酶家族、轉(zhuǎn)導(dǎo)家族蛋白、色氨酸合成相關(guān)蛋白、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子、富含亮氨酸重復(fù)序列型類受體蛋白激酶、α-葡聚糖水合二激酶、脂類相關(guān)家族蛋白、DNA結(jié)合／DNA相關(guān)RNA聚合酶、WD-40重組蛋白、SKIP1相互作用成分1、orf409、Prp9、Os02g0439200和功能未明的假設(shè)蛋白等。這些蛋白功能涉及蛋白合成、信號轉(zhuǎn)到、轉(zhuǎn)錄、初級代謝、光合作用、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運(yùn)子、蛋白儲存等。
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第一章文獻(xiàn)綜述(MDH服)和谷脆甘膚還原酶(GR)等;抗氧化劑類包括還原型谷朧甘膚(GSH)、抗壞血酸(AsA)和a生育酚(VitE).soD通過將氧自由墓(02一)歧化為氧分子和過氧化氫似202)起到抗氧化作用.而HZOZ則可以通過過氧化物酶(CAT、G一PoD或GPx)以及抗壞血酸一谷朧甘膚循環(huán)(AsA·GsH循環(huán))而清除(圖1.1)護(hù)‘a(chǎn)vindandPrasad，2005;Aroraetal.，2002;Asada，1992;FoyerandNoetor，2005;NoetorandFoyer，1998:Smimoff，1996)。

第四章谷朧甘肚合成對東南景天適應(yīng)福脅迫的影響(圖4.1)。特別是，在BsO和cd復(fù)合處理8天條件下，超積累生態(tài)型似E)東南景天根系和葉片中錫濃度相比100林M錫處理分別降低了41%(圖4.Ic)和36%(圖4.ld).習(xí)‘-CdJ卜ed+BsO根mot葉16af(b)NHE跳U八11

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