發(fā)布時(shí)間：2020-05-25 20:42

【摘要】：金屬硫蛋白(Metallothioneins,MTs)是一類分子質(zhì)量為6-7 kDa,富含半胱氨酸(約含30%)的可誘導(dǎo)的多功能蛋白。金屬硫蛋白廣泛存在微生物,植物及動(dòng)物等生物體中,扮演著清除非必需重金屬、調(diào)節(jié)必需重金屬濃度及抗氧化等重要功能。池蝶蚌是1997年從日本琵琶湖(Biwa Lake)引進(jìn)的一種具有重要商業(yè)價(jià)值的淡水珍珠育珠蚌。由于池蝶蚌營(yíng)底棲濾食性生活,加之其行動(dòng)緩慢,導(dǎo)致其不可避免并直接地暴露在含重金屬的水環(huán)境中。但是,到目前為止,有關(guān)淡水珍珠蚌金屬硫蛋白作為環(huán)境重金屬分子標(biāo)記物的探究,以及金屬硫蛋白基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究報(bào)道均較為罕見(jiàn)。本研究的主要內(nèi)容、結(jié)果和結(jié)論如下:1、分析和比較了正常情況下1齡、2齡及3齡池蝶蚌5種組織(鰓、外套膜、足、內(nèi)臟團(tuán)和消化腺)中鋅(Zn)、鎘(Cd)、鉛(Pb)及銅(Cu)4種重金屬含量。鰓是各種重金屬蓄積最高的組織,蓄積量約為35-60%。在1-3齡蚌中,各組織中Cd含量高低次序?yàn)?鰓消化腺外套膜內(nèi)臟團(tuán)足;各組織中Zn含量高低次序?yàn)?鰓外套膜≥足消化腺≥內(nèi)臟團(tuán);而在各組織中,Cu和Pb的含量沒(méi)有出現(xiàn)組織特異性:如1齡蚌的鰓組織中Cu的含量占比為60.06%,而3齡蚌的內(nèi)臟團(tuán)或者消化腺的Cu含量占比最高,約為35.12%,而鰓組織中僅為20.17%;各齡蚌中,在鰓組織中Pb含量占比最高,而其他4種組織并未出現(xiàn)一定的次序性。結(jié)果證明,池蝶蚌能積累一定濃度的重金屬,而鰓是重金屬積累的主要組織。進(jìn)一步,采用Cd脅迫實(shí)驗(yàn)(Cd濃度為0、0.005、0.05和0.5 mg/L,時(shí)間為1、3、5和7天),研究Cd脅迫下,1齡池蝶蚌體內(nèi)Cd的蓄積量及對(duì)應(yīng)MT的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在濃度為0.05和0.5 mg/L的Cd脅迫下,池蝶蚌體內(nèi)Cd的蓄積量和MT的水平都顯著提高(p0.01),但是并未發(fā)現(xiàn)兩者有時(shí)間積累效應(yīng)。相關(guān)性分析顯示,5種組織大部分時(shí)間點(diǎn)中Cd的累積量與MT的水平呈正相關(guān)。說(shuō)明池蝶蚌體內(nèi)的MT可作為監(jiān)測(cè)環(huán)境中Cd的分子標(biāo)記物。2、通過(guò)分子生物學(xué)方法,首次克隆了2個(gè)池蝶蚌金屬硫蛋白基因的cDNA序列(HsMT1和HsMT2)。結(jié)果顯示,HsMT1全長(zhǎng)589 bp,開放閱讀框216 b p,編碼71個(gè)氨基酸,蛋白分子質(zhì)量為7.14 kDa,等電點(diǎn)為7.24。HsMT1蛋白包含21個(gè)半胱氨酸(Cys),占總氨基酸的29.6%,缺乏組氨酸和芳香族氨基酸。蛋白結(jié)構(gòu)中包含9個(gè)Cys-X-Cys,1個(gè)Cys-X-X-Cys,6個(gè)Cys-X-X-X-Cys以及1個(gè)Cys-Cys結(jié)構(gòu)域(X代表了除Cys以外的其他氨基酸),在其C端保留有保守的金屬硫蛋白結(jié)構(gòu)域Cys-x-Cys-x(3)-Cys-Thr-Gly-Cys-x(3)-Cys-x-Cys-x(3)-C ys-x-Cys-Arg。而HsMT2全長(zhǎng)667 bp,開放閱讀框222 bp,編碼73個(gè)氨基酸,蛋白分子質(zhì)量為7.99 kDa,等電點(diǎn)為4.58。HsMT2蛋白半胱氨酸含量占總氨基酸的27.4%,含有組氨酸但缺乏芳香族氨基酸。蛋白結(jié)構(gòu)中包含8個(gè)Cys-X-Cys和7個(gè)Cys-X-X-X-Cys,在其C端結(jié)構(gòu)域?yàn)镃ys-x-Cys-x(3)-Cys-Lys-Gly-x(3)-Cys-x-Cys-x(3)-Cys-x-Cys-His。兩者Genbank的登陸號(hào)分別為KJ019820和KJ019821。HsMT1和HsMT2的同源性分析發(fā)現(xiàn),兩者雖然僅具有46.5%的相似性,但是在Cys區(qū)域顯示高度的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,HsMT1同其他貝類的聚為一起,而HsMT2卻脫離淡水和海水貝類MT并與斑馬魚聚為一支。熒光定量結(jié)果顯示,HsMT1在所有組織中均有表達(dá),并在肝胰腺中表達(dá)量最高,而HsMT2卻特異性地在性腺中高度表達(dá)。在5ppm濃度的重金屬Cd脅迫下,HsMT1和HsMT2的mRNA水平均出相似的表達(dá)模式,且呈現(xiàn)出“下降-恢復(fù)-下降”的趨勢(shì)。進(jìn)一步比較了轉(zhuǎn)HsMT1和HsMT2基因重組大腸桿菌的Cd耐受性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有HsMT1基因的大腸桿菌具有更高的Cd耐受性。這些結(jié)果揭示,池蝶蚌HsMT1和HsMT2基因是金屬硫蛋白家族成員,且均涉及金屬應(yīng)答反應(yīng),但是HsMT2可能還具有其他的生理功能。3、研究了池蝶蚌金屬硫蛋白基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,采用Genome walking和Genome walker方法,克隆獲得了長(zhǎng)度為1121和1270 bp的HsMT1和HsMT2的啟動(dòng)子序列(Genbank登陸號(hào)分別為KX279831和KX279832)。分析發(fā)現(xiàn),兩個(gè)啟動(dòng)子序列都含有豐富的腺嘌呤和胸腺嘧啶(A+T),其中HsMT1中A+T占比61.5%,而HsMT2中占比60.5%;其次,兩者都包含典型的TATA序列(TATAAA)。但是,兩個(gè)啟動(dòng)子的金屬應(yīng)答元件(Metal Response Elements,MREs)的數(shù)量和位置不同。HsMT1啟動(dòng)子區(qū)域含有一個(gè)MRE元件(TGCGCAC),位于起始密碼子上游的-588至-594 bp處,而HsMT2啟動(dòng)子區(qū)域含有近端和遠(yuǎn)端兩個(gè)MRE元件(TGCACAC和TGCGCAC),分別起始密碼子上游的-135至-141bp處和-540至-546處。進(jìn)一步構(gòu)建了啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告基因載體分析兩啟動(dòng)子功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在HepG2細(xì)胞中,HsMT1和HsMT2的啟動(dòng)子都可以被不同濃度的Zn~(2+)、Cu~(2+)和Cd~(2+)離子激活,并且表現(xiàn)出不同程度的金屬離子誘導(dǎo)性。截短啟動(dòng)子活性分析實(shí)驗(yàn)顯示,最長(zhǎng)的啟動(dòng)子具有最大的金屬誘導(dǎo)活性,并且這種活性依賴于HsMT1中的MRE或HsMT2中的遠(yuǎn)端MRE元件,一旦該元件缺失,啟動(dòng)子會(huì)喪失金屬誘導(dǎo)活性。4、進(jìn)一步克隆了1個(gè)金屬應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子類似物HsMTF-like(Metal responsive transcription factor like,MTF-like)。HsMTF-like cDNA全長(zhǎng)2033 bp,含有開放閱讀框1551 bp,編碼516個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量大小為57.32kDa。HsMTF-like蛋白中有6個(gè)保守的鋅指結(jié)構(gòu)域,與其他物種具有較高的保守性,如人(39.44%)、鼠(39.44%)、河豚(38.89%)和斑馬魚(38.89%)。其Genbank登陸號(hào)為KY211621。通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體(pcDNA-HsMTF-like)和含MRE突變的啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告基因載體,共轉(zhuǎn)染進(jìn)入HepG2細(xì)胞,探究在HepG2細(xì)胞中HsMTF-like對(duì)HsMT1和HsMT2基因表達(dá)影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HsMTF-like能通過(guò)與MRE相互作用,增強(qiáng)HsMT1和HsMT2的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平。并且金屬離子Zn~(2+)的刺激會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)該轉(zhuǎn)錄水平。同時(shí)發(fā)現(xiàn),HsMT2啟動(dòng)子中的兩個(gè)MRE元件在HsMT2基因激活過(guò)程中活性和所起貢獻(xiàn)有所不同。結(jié)合脊椎動(dòng)物和牡蠣MT轉(zhuǎn)錄機(jī)制的研究,認(rèn)為池蝶蚌MT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制應(yīng)該與脊椎動(dòng)物相似且在進(jìn)化過(guò)程中具有保守性。
【圖文】：

圖 1.2 重金屬清除曲線Fig.1.2 Curvilinear depuration of heavy metals.貝類體內(nèi)，重金屬的積累程度主要是依靠生物的或者非生物的變經(jīng)被證明是有效的生物監(jiān)測(cè)物種（Biomonitors），，主要基于以下幾能在不致死濃度的重金屬環(huán)境中積累重金屬，能持續(xù)不斷地暴露在以及方便取樣。在水體中，很多微量的元素都會(huì)對(duì)環(huán)境中生物有毒金屬濃度會(huì)導(dǎo)致金屬不耐受的物種減少甚至滅絕，因此對(duì)生物多樣影響。周圍環(huán)境或者食物中的積累的污染物會(huì)導(dǎo)致受影響生物的潛或者毒害食物鏈中更高等的生物，最終結(jié)果會(huì)毒害人類的健康。生量污染物對(duì)水體中生物影響。在研究過(guò)程中，用來(lái)生物監(jiān)測(cè)的物種有種或者引入種。依據(jù)考察污染物對(duì)生物的急性或慢性影響，確定間是短期還是長(zhǎng)期。受重金屬脅迫的貝類可能在發(fā)生生物化學(xué)的可能是重金屬脅迫后潛在的生物標(biāo)記物或者是重金屬在貝類體內(nèi)

圖 1.3 金屬硫蛋白與金屬離子結(jié)合模型。A 表示 apoMT 或 ZnMT 鰲合 Cd，阻斷 Cd 的毒性B 表示 MT 從其它 Cd 結(jié)合蛋白中抓取 Cd，使蛋白恢復(fù)結(jié)構(gòu)和功能；C 表示 MT 作為 Zn 供體，通過(guò) Zn/Cd 交換，將 Zn 供與 Cd 損害 ZnMT，使其結(jié)構(gòu)恢復(fù)[14]。Fig.1.3 Model of interactions of metallothionein (MT) with toxic metals and target of mettoxicity. (A) Metal-free apoMT or ZnMT binds cadmium, thereby interrupting the cadmium toxi(B)MT abstracts cadmium from a cadmium-impaired target protein and then restores structure anfunction to the target; (C)MT serves as a zinc donor to Cd-impaired ZnMT by the exchange Zn/Cd exchange, then restoring its structure and function[14].1.4 金屬硫蛋白的正負(fù)調(diào)控機(jī)制金屬硫蛋白的活性受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，包括 TATA 結(jié)合蛋白（TATA-bindinprotein，TBP）、TBP 相關(guān)因子以及 Sp1。另外，MT 也能被多種刺激物激活，包括金屬離子、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子[15]。一些轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被鑒定，如金屬應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子 1（Metal Responsive Transcription Factor-1，MTF-1），上游刺激因子（Upstream Stimulatory Factor, USF）以及核因子 1（Nuclear Factor，NF1）[16]。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4;X171.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 王誠(chéng)遠(yuǎn);胡芳琴;劉國(guó)鳳;王軍花;彭扣;盛軍慶;洪一江;;池蝶蚌金屬硫蛋白基因的原核表達(dá)及活性分析[J];南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(理科版);2014年02期

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2 谷美慧;草魚IRF-2下調(diào)IFN、PKR、PKZ轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制[D];南昌大學(xué);2015年

3 舒輕朝;池蝶蚌鐵蛋白的免疫功能及組織定位分析[D];南昌大學(xué);2015年

4 王誠(chéng)遠(yuǎn);池蝶蚌脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子LITAF基因的克隆及對(duì)Hela細(xì)胞的凋亡效應(yīng)[D];南昌大學(xué);2014年

5 何書豪;池蝶蚌鐵蛋白基因的特征與表達(dá)分析[D];南昌大學(xué);2012年

6 劉芳蘭;不同植核手術(shù)對(duì)池蝶蚌外套膜和珍珠囊中鈣調(diào)蛋白表達(dá)的影響[D];南昌大學(xué);2012年

7 李云娟;池蝶蚌外套膜組織學(xué)及鈣調(diào)蛋白基因的克隆和表達(dá)特性分析[D];南昌大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2680719