【摘要】：化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作用不可替代,而農(nóng)藥殘留污染的危害也日趨嚴(yán)重,這是人類亟需解決的一對(duì)矛盾。微生物原位修復(fù)被認(rèn)為是解決這一矛盾的有效手段,相關(guān)的理論和應(yīng)用研究方興未艾。農(nóng)藥污染通常是涉及多種農(nóng)藥的混合污染,所以,相對(duì)于單一性降解菌株,具有廣譜降解性能的菌株在農(nóng)藥污染修復(fù)中更有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值;同時(shí),農(nóng)藥殘留微生物降解分子機(jī)制的闡明也將為微生物修復(fù)提供理論指導(dǎo)。 在前期的工作中,本實(shí)驗(yàn)室分離了一株廣譜農(nóng)藥降解菌Paracoccus versutus M-1。菌株M-1能夠降解有機(jī)磷殺蟲劑久效磷、敵敵畏、磷胺和酰胺類除草劑敵稗、乙草胺、丁草胺。該菌株及其開發(fā)的菌劑已申請(qǐng)了國家專利保護(hù),并在應(yīng)用中發(fā)揮了重要作用。本研究以菌株M-1為研究材料,試圖揭示其降解不同種農(nóng)藥殘留的分子機(jī)制,以期為其應(yīng)用提供理論參考。 1.菌株M-1的降解譜 M-1底物降解譜測(cè)定顯示,除了上述底物外,M-1還能降解有機(jī)磷殺蟲劑甲基對(duì)硫磷、甲基對(duì)氧磷和酰胺類化工中間體丙烯酰胺、苯甲酰胺、苯乙酰胺。在溫度30℃,pH7.5,裝液量為100/250mL,和1%接種量的加富培養(yǎng)基中,48小時(shí),M-1對(duì)50ppm的甲基對(duì)硫磷和甲基對(duì)氧磷的降解效率分別為87.2%和93.4%。在溫度30℃,pH7.5,裝液量為100/250mL,和1%接種量的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,12小時(shí),M-1對(duì)100ppm的丙烯酰胺、苯甲酰胺和苯乙酰胺的降解效率分別為96.3%、94.1%和89.20%. 2.敵稗水解酶基因的克隆及酶學(xué)研究 通過菌株在含敵稗的LB平板上產(chǎn)生水解圈的現(xiàn)象作為篩選標(biāo)記,鳥槍法構(gòu)建菌株P(guān)aracoccus sp.Ml基因組文庫�？寺〕鲆粋�(gè)新的酰胺水解酶的基因pamh,該ORF大小為1434bp,編碼477個(gè)氨基酸,在起始密碼子ATG的上游5bp處有一可能的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(AGGAGA), pamh的G+C含量為49.30%。pamh基因序列的Blast比對(duì)顯示,在氨基酸水平上與已鑒定的酰胺酶最高同源性為31%�；盍ξ稽c(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)PamH具有酰胺酶特征家族的保守的Lys-Ser-Ser催化中心,將這三個(gè)位點(diǎn)分別突變?yōu)楸彼岷?PamH均喪失活力。因此確定PamH是屬于酰胺酶特征家族的一個(gè)新成員。 優(yōu)化了PamH在E. coli BL21中最佳表達(dá)條件：以LBP培養(yǎng)菌株,裝液量為150/500ml,置于搖床200rpm/min,菌體長(zhǎng)到OD600=1.0時(shí)加入終濃度為0.005-0.01mM的IPTG,18-25℃,誘導(dǎo)表達(dá)8-10小時(shí)。其表達(dá)量比正常發(fā)酵時(shí)提高了20至30倍。經(jīng)過純化獲得單一的PamH,大小約為52KDa,與預(yù)測(cè)的分子量52,390Da相一致。等電點(diǎn)(pI)為5.13。 PamH在45℃以下和pH5.0～10.0時(shí)比較穩(wěn)定,PamH水解敵稗的最適溫度為40℃,最適pH為8.0。大部分金屬離子對(duì)PamH活力無影響,Hg2+, Co2+和Cu2+嚴(yán)重抑PamH的活力,而加入1mM的Mn2+和Mg2+對(duì)PamH的活力分別增強(qiáng)10%和30%。10mM的EDTA和1,10-菲羅啉對(duì)PamH活力無影響,說明PamH催化活力不需要金屬輔助因子。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF則強(qiáng)烈抑制該酶的活力。巰基試劑pCMB和碘乙酰胺(1mM)以及表面活力劑SDS, Tween-80, Triton X-100(10mM)抑制PamH40-70%的活力。 PamH對(duì)大部分芳香族和短鏈脂肪族的酰胺化合物水解活力較高,如,乙酰胺,丙酰胺,苯甲酰胺和苯乙酰胺。苯甲酰胺苯環(huán)上一個(gè)或兩個(gè)C被N取代后,Pam對(duì)其水解活力明顯降低,如,PamH對(duì)尼克酰胺和吡嗪酰胺的催化活力比苯甲酰胺分別降低了43%和49%。在本實(shí)驗(yàn)條件下,1mg的PamH在1min內(nèi)可以水解丙烯酰胺產(chǎn)生14.33μM丙烯酸,丙烯酸是生產(chǎn)聚合物的重要的工業(yè)原料。PamH還對(duì)部分氨基酸類的酰胺底物(天冬酰胺,丙氨酰胺和谷氨酰胺)和尿素有微弱的活力,而對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪族酰胺化合物正己酰胺未檢測(cè)到活力。PamH對(duì)敵稗的Km和Kcat分別是158μM和2.8s-1,在最佳反應(yīng)條件下的催化效率值為0.018μM-1·s-1。而其它被嘗試的敵稗類似結(jié)構(gòu)的酰胺化合物均不能被其水解,包括乙草胺,丁草胺,對(duì)硝基乙酰苯胺和對(duì)氯乙酰苯胺。 PamH還具有酰基轉(zhuǎn)移活力,以反應(yīng)生成1mM甲基異羥肟酸為100%酶活。PamH對(duì)甲酰胺和異丁酰胺具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力相對(duì)活性分別為139%和178%。此外,PamH對(duì)芳基�；０坊衔锿瑯泳哂絮；D(zhuǎn)移酶活力,其對(duì)敵稗和對(duì)硝基乙酰苯胺的�；D(zhuǎn)移相對(duì)活性分別為34%和79%。 3.有機(jī)磷水解酶基因的克隆及酶學(xué)研究 通過鳥槍法構(gòu)建菌株P(guān)aracoccus sp.M1基因組文庫,獲得一個(gè)β-內(nèi)酰胺酶家族的甲基對(duì)氧磷水解酶基因mpdp, ORF大小為975bp,編碼324個(gè)氨基酸。mpdp基因序列的Blast比對(duì)顯示,在氨基酸水平上與已鑒定蛋白最高同源性為38%；與Pseudomonas sp Wbc-3中的甲基對(duì)硫磷水解酶MPH同源性為33%。并且Mpdp的序列中具有甲基對(duì)硫磷水解酶的保守序列His-X-His-X-Asp-His,因此確定Mpdp是屬于β-內(nèi)酰胺金屬酶家族的一個(gè)新蛋白。 Mpdp的底物譜較窄,僅對(duì)甲基對(duì)氧磷、甲基對(duì)硫磷和乙基對(duì)氧磷有催化活力。Mpdp水解甲基對(duì)氧磷Km和kcat值分別為286μM和14.8s-1。在最佳反應(yīng)條件下的催化效率值為0.052min-1μM-1。 通過易錯(cuò)PCR獲得了5個(gè)活力提高的突變子,其中活力最高的Mpp1對(duì)甲基對(duì)氧磷、乙基對(duì)氧磷和甲基對(duì)硫磷的比酶活分別為81.4、5.8、0.72U/mg比原始酶活分別提高了11.2、7.1、4.5倍。在單位點(diǎn)突變中K160R、K176R和A276V的kcat/Km比原始Mpdp分別提高了2.3、10和4.5倍,而同時(shí)含有這三個(gè)突變位點(diǎn)的Mppl對(duì)甲基對(duì)氧磷的動(dòng)力學(xué)參數(shù)kcat和kcat/Km比原始Mpdp分別提高9倍和24.5倍。
【圖文】：

生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生二甲基硫代a愃帷⒀竅嵫魏捅嬌嶗轡鎦實(shí)拇恢屑洳鎩８萁峁治鐾撇餳諄粵騛惤到饌揪度繽，

本文編號(hào)：2679711