【摘要】：有機(jī)廢水的光合細(xì)菌(PSB)處理技術(shù),不僅可以有效去除廢水中的有機(jī)污染物,同時(shí)還能回收菌體蛋白、類(lèi)胡蘿卜素和5-氨基乙酰丙酸(ALA)等高價(jià)值物質(zhì),得到了廣泛關(guān)注和研究。然而,以PSB處理食品加工廢水時(shí),普遍存在污染物去除率不理想,菌體產(chǎn)量及類(lèi)胡蘿卜素、ALA等高價(jià)值物質(zhì)產(chǎn)率不高等不足,阻礙了PSB技術(shù)在廢水處理領(lǐng)域的推廣和應(yīng)用。本文在對(duì)多株紫色非硫細(xì)菌(PNSB)的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物合成進(jìn)行比較和優(yōu)選的基礎(chǔ)上,分別以Rhodopseudomonas palustris(Rp.palustris)和Rhodobacter sphaeriodes(Rb.sphaeriodes)構(gòu)建了以食品加工廢水為基質(zhì)的類(lèi)胡蘿卜素和ALA生物合成系統(tǒng),通過(guò)批式培養(yǎng)和連續(xù)流培養(yǎng)方式研究了關(guān)鍵因素的影響,優(yōu)化了控制參數(shù),并基于能量代謝和物質(zhì)合成途徑,從分子水平探討了關(guān)鍵因子調(diào)控PNSB處理廢水的生物學(xué)機(jī)制。研究結(jié)果表明,以PNSB處理食品加工廢水同時(shí)生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素或ALA的技術(shù)是可行的。在受試的4個(gè)菌種中,Rp.palustris合成類(lèi)胡蘿卜素的能力最強(qiáng),而Rb.sphaeriodes更適合用于ALA的生產(chǎn);培養(yǎng)Rp.palustris和Rb.sphaeriodes的最佳基質(zhì)分別為有機(jī)揮發(fā)酸生產(chǎn)廢水和大豆蛋白生產(chǎn)廢水。Rp.palustris和Rb.sphaeriodes的生長(zhǎng)可采用Logistic模型進(jìn)行模擬和預(yù)測(cè),而對(duì)類(lèi)胡蘿卜素和ALA合成過(guò)程的模擬和預(yù)測(cè)則以Luedeking Piret模型為好。從PNSB-活性污泥混合培養(yǎng)系統(tǒng)中篩選到6株芽孢桿菌(Bacillus sp.),它們均對(duì)Rp.palustris和Rb.sphaeriodes的生長(zhǎng)和類(lèi)胡蘿卜素或ALA的合成有促進(jìn)作用,其中以菌株L2的效果最為明顯,可以用作PNSB生長(zhǎng)和物質(zhì)合成的促進(jìn)菌劑。Mg~(2+)、光強(qiáng)和光周期、pH和適宜的附加菌劑都可對(duì)Rp.palustris的類(lèi)胡蘿卜素合成產(chǎn)生顯著影響。在Mg~(2+)濃度15 mmol/L、5000 lux、光照和黑暗時(shí)間比4:2、p H 8.0和菌劑劑量40μL/L等條件下,Rp.palustris以有機(jī)揮發(fā)酸生產(chǎn)廢水為基質(zhì)的菌體產(chǎn)量和類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)率分別可達(dá)3.90 g/L和4.83mg/g-DCW。功能基因分析表明,Mg~(2+)是通過(guò)調(diào)控crt基因表達(dá)而影響類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)率的,而附加菌劑可以通過(guò)抑制過(guò)氧化物酶活性對(duì)類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)率產(chǎn)生促進(jìn)作用。光照過(guò)強(qiáng),會(huì)抑制PNSB生長(zhǎng),一定的黑暗刺激則有利于類(lèi)胡蘿卜素的合成。p H在一定范圍內(nèi)的升高,可將生物合成系統(tǒng)的氧化還原電位(ORP)控制在較低水平,有利于類(lèi)胡蘿卜素的合成。對(duì)Rb.sphaeriodes合成ALA的研究表明,Fe~(2+)、合成底物(琥珀酸、甘氨酸和葡萄糖)和附加菌劑是影響ALA合成的關(guān)鍵因子,在Fe~(2+)濃度400μmol/L、3000 lux、菌劑劑量40μL/L,以及琥珀酸、甘氨酸和葡萄糖分別為8.56、5.06和7.82 mmol/L等條件下,Rb.sphaeriodes以大豆蛋白生產(chǎn)廢水為基質(zhì)的菌體產(chǎn)量和ALA產(chǎn)率分別可達(dá)4.02 g/L和15.86 mg/g-DCW。Fe~(2+)的調(diào)控機(jī)制與ALA生物合成途徑中的關(guān)鍵酶活性、ATP產(chǎn)率及關(guān)鍵功能基因的表達(dá)有關(guān)。在批式培養(yǎng)和機(jī)制探討的基礎(chǔ)上,以Rp.palustris和Rb.sphaeriodes分別構(gòu)建了連續(xù)流食品加工廢水生物處理系統(tǒng),分別用于有機(jī)揮發(fā)酸生產(chǎn)廢水和大豆蛋白生產(chǎn)廢水的處理,以及類(lèi)胡蘿卜素和ALA的生物合成。結(jié)果表明,對(duì)于由Rp.palustris構(gòu)建的連續(xù)流生物處理系統(tǒng),在HRT 48 h、有機(jī)負(fù)荷(OLR)2.51 g/L/d、Mg~(2+)濃度15 mmol/L、5000 lux、光照和黑暗時(shí)間比4:2、p H 7.0左右和菌劑劑量40μL/L的條件下,對(duì)廢水的COD去除率平均為85.7%,可獲得1.36 g-DCW/L/d的菌體產(chǎn)率和5.32 mg/L/d左右的類(lèi)胡蘿卜素合成速率產(chǎn)率,類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)率達(dá)到了3.92 mg/g-DCW。以Rb.sphaeriodes構(gòu)建的處理大豆蛋白生產(chǎn)廢水系統(tǒng),在HRT 60 h、OLR 2.48 g/L/d、Fe~(2+)濃度400μmol/L、3000 lux、菌劑劑量40μL/L等條件下,COD平均去除率高達(dá)89.5%,菌體產(chǎn)率和ALA合成速率可分別穩(wěn)定在1.06 g-DCW/L/d和7.86 mg/L/d左右,ALA產(chǎn)率平均為7.40 mg/g-DCW。
【圖文】：

經(jīng)過(guò)（37℃溫浴 5 min，42℃溫浴 60 min，70℃溫浴 10 min）后終止反應(yīng)。將上述產(chǎn)物置于-20℃保藏備用。2.3.5.3 實(shí)時(shí)定量 PCR 基因表達(dá)分析構(gòu)建反應(yīng)體系：10 μL SYBR Green qPCR 混合物（Taq DNA 聚合酶，dNTP，MgCl2和 SYBR Green I 染料），1 μL 正向引物，1 μL 反向引物，1 μLcDNA 模板和 7 μL 去 RNA 酶 ddH2O。于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（StepOne plus型，美國(guó) ABI 公司）95℃預(yù)變性 2 min，接 40 個(gè)循環(huán)，，每個(gè)循環(huán)包括 95℃變性 10 s，60℃退火/延伸 40 s。目的基因擴(kuò)增曲線和熔解曲線如圖 2-3 所示。各目的基因的引物信息見(jiàn)表 2-9。2.3.5.4 基因表達(dá)水平的計(jì)算方法實(shí)時(shí)定量 PCR 采用比較 Ct法（ Ct）計(jì)算基因表達(dá)量，以 16S rRNA 基因?yàn)閮?nèi)參基因，未處理樣品作對(duì)照。目標(biāo)基因表達(dá)的變化（誘導(dǎo)率）通過(guò)未處理樣本的差異倍數(shù)來(lái)表示。相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式如下：相對(duì)表達(dá)量 - -( -[( (2 2 2t t t t t t t C C C C C C C 處理- 對(duì)照） 處理- 內(nèi)參）- 對(duì)照- 內(nèi)參)]（2-6）

第 2 章 試驗(yàn)L 為 DNA 與載體連接片段長(zhǎng)度，bp；D 為轉(zhuǎn)換因子，總堿基對(duì) 650。將標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋后，制作標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線分別如圖 2-4 和 表 2-11 總細(xì)菌和 PNSB 目Table 2-11 Summary of standard curves for p目標(biāo)菌 模板 標(biāo)準(zhǔn)方程總細(xì)菌 質(zhì)粒 Y = -3.99447 x + 44.6342PNSB 質(zhì)粒 Y = -3.74983 x + 42.0315(a)
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：X792


本文編號(hào)：2677614